组织样品的Western Blot实验具有一定的挑战性，想要得到可重复且高可靠性的图像并非易事。我们总结了组织样品WB实验的10个技巧帮助您获得更干净的条带及可靠的WB数据。
这10个技巧包括：
快速处理组织样品
谨慎选择裂解缓冲液
选择最佳的破碎方法
样品制备过程中抑制蛋白质降解并保留翻译后修饰
上样前的蛋白定量
选择适合的凝胶
验证蛋白上样量
选择合适的转印膜
减少内源性免疫球蛋白的高背景
合适的对照
本期我们将详细介绍前5项技巧，下期则为您介绍后面的5项。请您持续关注伯乐生命科学公众号，获得更多的实验技巧。
务必使用清洁过的工具收获和处理组织样本。为去除可能影响蛋白稳定性的污染物，请在预冷的中性 pH 缓冲液中简单清洗样本，然后将组织快速冷冻在液氮中，以保留蛋白质结构及其特征（如翻译后修饰）。立即将组织样本在冰上均质化处理。由于蛋白质在–20°C下仍可能发生降解，因此组织样本应在–80°C下长期保存。
选择合适的裂解缓冲液以有效从组织中提取蛋白质。请务必考虑 pH、离子强度以及去污剂、变性剂类型等参数对蛋白提取效率的影响，RIPA是使用最广泛的裂解缓冲液。在选择缓冲液时还应考虑目标蛋白的细胞定位；例如，对于细胞质蛋白，建议使用 Tris-HCl 裂解缓冲液，而提取核蛋白则首选 RIPA。为了富集膜、细胞质或核组分中的低丰度蛋白，可能需要组织分级分离。裂解缓冲液的量取决于组织的大小/重量；考虑缓冲液与组织的比率对于确保有效裂解很重要。首次建立从组织中提取蛋白方案时，请尝试不同的裂解缓冲液以优化适合您的组织类型和特定蛋白质的条件。
与细胞相比，组织需要更严格的破坏、均质方法。为了进一步解离组织并剪切 DNA，可能需要对样品进行超声处理。在此步骤中避免起泡非常重要，因为它可能会降低蛋白的收率。确保您已优化机械破碎器的功率设置并预冷设备。
脂质会影响WB条带的质量，因此请确保去除样品中的脂肪。从植物组织中提取蛋白特别具有挑战性，因为它们富含蛋白酶，并且含有高水平的代谢物，可能会干扰蛋白质的提取。提取过程必须针对您所使用的特定植物组织进行优化。针对植物组织蛋白提取方案可采用三氯乙酸/丙酮沉淀法或苯酚提取法等优化方案。
细胞膜的破坏会释放出可以降解蛋白质的酶，尽管将样品保持在低温下，以最大限度地减少蛋白质的活性。为了限制蛋白酶活性，可在缓冲液中添加强变性剂：如尿素等。 然而，这些条件可能会影响某些蛋白质的完整性；因此，裂解缓冲液通常添加蛋白酶抑制剂混合物。常见的蛋白酶抑制剂包括苯甲基磺酰氟 (PMSF)、抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素。
类泛素化蛋白质的鉴定尤其具有挑战性。这是由于异肽酶的活性可以去除类泛素化缀合物，并且通常只有一小部分蛋白质被类泛素化。因此，为了保护类泛素化，建议在裂解缓冲液中添加异肽酶抑制剂。蛋白质泛素水解酶（称为去泛素酶 (DUB)）也可以轻松去除泛素缀合物。因此，必须在细胞裂解缓冲液中添加 EDTA 或 EGTA 以及碘乙酰胺 (IAA) 或 N-乙基马来酰亚胺 (NEM)。IAA 和 NEM 的常用浓度为 5-10 mM。然而，高达十倍的浓度对于维持某些蛋白质（例如 IRAK1）的泛素化至关重要。用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理还可以保留泛素化并阻止 26S 蛋白酶体的蛋白质降解。
定量样品浓度可确保凝胶上样量相等，并使您能够比较经过处理的样品与未经处理的样品或实验过程中蛋白质水平的差异。 Bradford 检测通常用于总蛋白上样量的测定。然而，如果样品同时含不溶性和可溶性蛋白质，或样品中含有一定量的表明活性剂时，则Bradford方法并不可靠，这再次强调了适当均质化的重要性，或合适的定量方法的重要性。
下期中我们会继续为您介绍组织裂解物WB实验的其他5个实验技巧
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