流式进阶秘籍（二） | 荧光染料学明白，流式实验轻松做

在我们的流式实验中，无一不会接触到荧光蛋白或染料。选择合适的荧光染料对于成功的流式实验设计至关重要。深入了解荧光染料的特性，能让我们在流式实验中游刃有余。下面就让我们一起来学习流式进阶秘籍之荧光染料篇吧！

细胞上标记的荧光染料在流式细胞仪中被激光激发，而激发和发射的过程都伴随着能量的改变。当荧光团吸收光时，其电子会被激发，并从静止状态（S₀，图1）跃迁到最大能级，称为激发电子单重态（S₂）。对于每个荧光团，此转换所需的能量不同。激发态的持续时间取决于荧光染料，通常持续1-10ns。然后，荧光染料发生构象变化，电子下降到称为电子单重态（S₁）的更低、更稳定的能级，在此过程中一部分吸收的能量作为热量被释放。电子随后回到其静止状态（S₀），释放出剩余的能量（E_发射）作为荧光。对于单个荧光团，此循环可以重复数千次，从而可以回收荧光团，进而放大信号。

由于激发荧光染料的能量比其发射出的光的能量高，所以任何荧光染料的发射波长都比其激发波长更长，因此可对应于电磁光谱上不同的颜色。

在激发光的峰值处称为最大激发波长，在该波长可以激发出最强的荧光；在发射光的峰值称为最大发射波长，在该波长可以收集到最强的荧光信号。例如FITC染料，通常使用接近FITC的490nm吸收峰的488nm蓝色激光来激发该荧光团。FITC发出475nm至650nm的荧光，在525nm处达到峰值，落在绿色光谱内。

流式细胞仪的滤光片设置决定染料检测的信号值，如图2中，在A区域可以收集到最强的发射光信号，而在B区域只能收集到很弱的发射光信号。通过荧光光谱查看器可查询感兴趣荧光染料的光谱信息：https://www.bio-rad-antibodies.com/spectraviewer.html。

经过多年发展，目前市面上已有许多不同种类的流式荧光染料，例如单体染料、串联染料以及荧光蛋白等，并且可用的荧光染料种类仍在不断增加。

传统染料如FITC、PE、APC等单体染料已被使用多年，而新型单体染料也在逐步上市，如Bio-Rad StarBright系列染料等，其具有比传统染料更高的光稳定性和更亮的荧光。不断优化和拓展的单体染料可以匹配多色实验设计和多色流式细胞仪，极大降低多色流式实验的染料选择难度。

Axxx，Alexa Fluor；APC，别藻蓝蛋白；FITC，异硫氰酸荧光素；PE，藻红蛋白；PerCP，多甲藻素叶绿素蛋白。

与单体染料不同，串联染料则是将一种单体染料共价偶联到另外一种单体染料上，以FRET的形式激发，例如PE-cy5，PerCP-cy5.5、APC-cy7等。串联染料的出现降低了染料对仪器激光的配置要求，拓展了多色流式实验。但是串联染料依赖其FRET效率，不同厂家或不同批次的串联染料FRET效率会有差别。串联染料的稳定性较差，长期存放可能会导致两种单体染料间的偶联键断裂。上述这些都会对荧光补偿或光谱解析造成影响，在使用的时候需要注意。

Axxx，Alexa Fluor；APC，别藻蓝蛋白；Cy，花青；PE，藻红蛋白；PerCP，多甲藻素叶绿素蛋白。

常见荧光蛋白有GFP、YFP、mCherry、tdTomato等，目前已经成为科学领域了解蛋白质表达的不可或缺的工具，通常共表达或表达为与目标蛋白的融合体。在流式实验中使用荧光蛋白可以定量活细胞中的细胞内标记物，并在这个过程中无需透化细胞膜。

CFP，青色荧光蛋白；EBFP，增强的蓝色荧光蛋白；EGFP，增强的绿色荧光蛋白；GFP，绿色荧光蛋白；RFP，红色荧光蛋白；YFP，黄色荧光