在细胞外囊泡EV，特别是外泌体的WB鉴定实验中，我们通常需要同时检测多个蛋白的相关Marker。在“MISEV2018”中EV的蛋白Marker表征建议做到“三阳一阴”，即：至少三种阳性蛋白标记，包括至少一种跨膜/脂质结合蛋白，一种胞质蛋白；至少一种阴性蛋白标记。有兴趣详细了解MISEV2018指导原则的朋友可以自行查阅文献（doi: 10.1080/20013078.2018.1535750）。
对于EV的Western鉴定，甚至是定量实验而言，通常尧检测的蛋白Marker包括：CD63、CD81、CD9、ALIX、FLOT1、ICAM1、EpCam、ANXA5、TSG101及热休克蛋白70等；此外，研究中通常还涉及其他和EV来源相关的蛋白检测。那么EV的Western实验设计就变的相对复杂，需要在实验中同时检测多个分子量相近的蛋白Marker。例如：同为CD分子的CD9和CD81，分子量基本上都在25kD左右；CD63因为存在广泛的糖基化情况，导致条带弥散在25-50kD范围的位置，容易和其他蛋白条带产生重叠。
对于这样的EV蛋白Marker检测难点，很多研究者不得不使用跑多块胶、转多块膜，或抗体重杂交的方式完成实验，但这样的操作不但复杂耗时，而且特别会导致结果的不准确。那么有更方便的方法来解决EV Western检测的困境吗？
答案是多重荧光WB技术。
西班牙Jesús Usón干细胞治疗中心的人员研究在促炎刺激、生理缺氧和急性缺氧预处理条件下的EV治疗潜力时，对多达7个蛋白marker进行了Western实验检测（参考文献1）。
细胞裂解液CL及EV的蛋白marker检测
（图源：https://doi.org/10.1186/s13287-023-03413-5）
其中，靶标涉及多个分子量位置相近的蛋白。实验人员采用了红外荧光检测+化学发光检测的方法实现了位置相近蛋白的同时检测。因为荧光与化学发光的检测波长与通道的差异，可实现对相同位置条带的同时检测。该研究论文中使用到的相关检测方法如下表，有兴趣了解具体实验步骤的研究者可以去查阅全文。
Antigen |
Observed molecular weight (MW) |
Host species |
Signal detection method |
ALIX |
100 kDa |
Mouse |
Chemiluminescence |
CANX |
110/130 kDa |
Rabbit |
Fluorescence |
CD63 |
45-55 kDa |
Mouse |
Chemiluminescence |
CD81 |
25 kDa |
Mouse |
Chemiluminescence |
FLOT1 |
50 kDa |
Mouse |
Chemiluminescence |
GAPDH |
37 kDa |
Rabbit |
Fluorescence |
TSG101 |
52 kDa |
Rabbit |
Fluorescence |
为实现EV跨膜marker CD81和正呼肠孤病毒marker的同时检测，范德比尔特大学医学中心的研究者也使用了多色荧光WB技术来设计实验（参考文献2）。IRDye800和IRDye680两种不同荧光染料标记的抗体用于不同靶蛋白的检测（如下图）。
图源：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1011637
为实现标准化的EV蛋白marker检测，Bio-Rad德国应用实验室的科学家也开发了相应的多色荧光WB EV检测方案，该方案可以同时检测多达5种蛋白marker。下图展示了该多色荧光WB实验检测EV样品的结果，靶标蛋白包括：CD9、CD81、Alix(1)、Alix(2)及Annexin A5。
该多色荧光WB使用了红外、近红外等多个荧光通道及对应的二抗，在Bio-Rad全能型成像系统ChemiDoc MP上实现检测。如需了解更多的多色荧光WB实验及ChemiDoc MP系统，请填写表单信息，我们的代表将尽快与您取得联系。
参
考
文
献
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* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。