如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-2（上）- 大数跨境

广州市昊洋贸易有限公司

2023-10-31

反转录 qPCR（RT-qPCR）被认为是当今准确、灵敏、快速测量基因表达的黄金标准。遗憾的是，许多用户没有意识到，在得出具有生物学意义和可信的结论之前，需要解决工作流程中的许多关键问题。在此，我们将回顾整个工作流程，从实验计划和准备阶段，到 qPCR 实验过程，报告步骤的整个工作流程。这个过程可以用 PCR 的缩写来概括：P，Plan 计划/准备；C，Cycle PCR 循环；R，Report 报告，合起来就是 PCR。

图1: 整个 qPCR 工作流程中需要质量控制的步骤或注意事项

在整个 RT-qPCR 工作流程中，质量保证和质量控制至关重要；从活细胞、核酸提取、储存、各种酶解步骤（如 DNase 处理）、反转录和 PCR 扩增，到数据分析以及最终的结果报告。

今天小编来帮大家理一理如何正确的利用 qPCR 技术开展基因表达分析实验，希望对大家有所帮助。

◆ ◆ ◆ ◆

一、机会总是眷顾有准备的人

反转录定量 PCR（RT-qPCR）在准确性、灵敏度和简便快速出结果方面有别于其他基因表达分析方法。因此，该技术已成为中等通量基因表达分析的金标准。然而，在进行 RT-qPCR 时应小心谨慎，因为在整个工作流程中可能会出现许多关键的质量问题，影响结果的准确性和结论的可靠性。强化质量控制是一个重要而必要的环节，可以用 PCR 的缩写来概括：P 计划/准备、C 循环和 R 报告（如图1）。在第一节中，我们将说明 RT-qPCR 工作流程中的四个重要准备步骤。严谨的实验设计、样品的质量控制、assay 的质量控制、选择适当的参考基因进行归一化，将大大增加获得成功结果的几率；总之好的开头就是成功的一半。

1.1实验设计

在建立 RT-qPCR 研究时，最容易被忽视的一点就是实验设计。但我们知道，正确的实验设计可以节省时间、降低试剂成本并提高结果的准确性和精确度。实验设计包括3个重要方面：

首先，功效分析应能仔细评估得出有意义和统计学意义的结果所需的生物样本数量。

研究人员经常会遇到样本太少的情况，无法证明实验中观察到的差异表达具有显著性。

其次，应选择适当的反应板布局策略。

在 RT-qPCR 研究中，可以采用两种不同的板布局。

· 首选样本最大化方法，即在同一次运行中分析尽可能多的样本，在同一个反应板中涵盖尽可能多的同一种靶标基因，这意味着，如果没有足够的空余反应孔来在同一次运行中分析不同的基因，则应在不同的批次中分析不同的基因。相比之下，基因最大化板布局则是在同一批次中分析多个基因，并根据需要将样本分散到不同的批次中。

· 后一种方法通常用于商业试剂盒或前瞻性研究。要认识到，在相对定量研究中，实验者通常对比较不同样本间特定基因的表达水平感兴趣。因此，强烈推荐使用样本最大化方法，因为它不会受到样本间由于技术差异、批次间差异（通常被低估）的影响。

· 然而，无论采用哪种板布局，只要不是所有的样品都在同一次运行中进行分析，就需要进行板间校准，以校正批次间可能存在的差异。为此，实验人员需要分析所谓的批次间校准品（IRC），它其实是在两个批次中设置相同样品，通过测量两次运行中 IRC 之间的 Cq 或归一化后相对量的差异，就可以计算出校正或校准因子，以消除批次间的差异，并像在同一次运行中分析所有样品一样进行分析。

Bio-Rad CFX Maestro 软件中相对定量模型就采用了这种更准确的批次间间校准方案。除了基因与样本最大化等理论上的考虑之外，还有一些实际原因需要考虑板布局。

与样品、试剂的成本相比，微孔板的成本微不足道，因此没有必要一定在同一个板上进行所有的反应，直到完全布满板子为止。相反，为了使移液方案更合理或更实用，留空一些反应孔可能更合适。不仅方便了运行注释，还可以使用多通道移液器或分液机器人进行方便的移液，并防止反应板配置过程中出现错误。因此，有些实验更适合使用384 孔仪器，因为其耗材成本更低，结果更快，数据质量更高，更容易避免运行之间的技术差异。

1.2样本提取和质量评估

二代测序领域已经认识到对高质量核酸的需求，此类实验的成本促使人们对上样的 RNA 分子的纯度和完整性进行评估。相比之下，RT-qPCR 的成本相对较低，但即使模板高度降解，如福尔马林固定的石蜡包埋组织，也几乎总是能得到漂亮的扩增曲线。因此，不知情的用户很容易被误导，也可能无法理解 RNA 质量对结果的影响。

计算机科学中的一句名言 "垃圾进，垃圾出 "同样适用于 qPCR。由于 RT-qPCR 性能受 RNA 完整性的影响，Fleige 和 Pfaffl 建议用于下游应用的 RNA 质量得分（RIN 或 RQI）高于5分则表示总 RNA 质量良好，高于8分则为总 RNA 质量完美。一项关于 RNA 质量对参考基因表达稳定性影响的研究表明，不适合对降解样本和完整样本进行比较，因此有必要在 RT-qPCR 测量前对样本进行质量控制。

我们最近的数据表明，RNA 质量对结果有深远影响，包括差异表达的意义、参考基因的变异性和多基因特征的分类性能。除了使用毛细管凝胶电泳方法评估核糖体 RNA 分子的完整性之外，或作为替代方法，基于PCR 的检测也经常被用来确定 mRNA 的完整性。其中一种检测方法是在锚定 oligo-dT cDNA 合成过程中测量普遍基因表达中的5'端和3'端之间的比率，以反映特定多腺苷酸化转录本的完整性。最后，另一种基于 PCR 的检测方法通常用于临床诊断，以确定样本的纯度。通过将已知浓度的标准 DNA 或 RNA 分别加入阴性水对照和未知质量样本中，比较 Cq 值以确定抑制作用。

除纯度和完整性外，RNA 样本还有第3个重要要求：

· 不含污染 DNA。虽然有时可以设计一种跨越大内含子的检测方法，使残留 DNA 不被共扩增，但不建议采用这种方法。首先，这会使设计过程变得更加繁琐；其次，对于多达 20% 的人类基因来说，这种方法是行不通的，因为这些基因要么是单外显子基因，要么在基因组中有一个或多个经过处理的假基因。

· 我们手中最有效的策略是进行适当的 DNase 处理，然后通过对粗提取 RNA 上的DNA 靶标进行 qPCR 分析，仔细检查是否存在DNA。如果没有观察到扩增信号，则说明 RNA 不含 DNA。

关于 RNA 样本，最后一个值得关注的问题是越来越多地使用样本预扩增方案。事实上，许多生物标本都很珍贵，但提取的 RNA 数量过低往往限制了大规模基因表达研究。RNA 预扩增方法可以解决这个问题，从几纳克的总 RN A开始生产微克级的 cDNA。在使用现有的各种扩增方案之前，只有一个重要的标准需要评估：两个样本之间表达量的倍数变化在扩增前后应保持一致。由于不同靶标的预扩增效率可能不同，因此比较预扩增前后的基因无关紧要。因此，转录本变异分析只能在预扩增之前进行。

1.3 assay 的设计和质量控制

另一个重要的准备步骤是设计 qPCR 检测方法（assay）并进行经验验证。检测方法有多种来源。您可以使用免费的或市面上在售的设计软件自行设计，也可以从提供现成检测方法或按需设计的专业供应商处购买检测方法。第三种方法是在 https://qprimerdb.biodb.org/analysis 等公共数据库中查找已发表并经过实验验证的检测方法，上述数据库中包含近1870万个基因和相应的 assay，主要来1308种生物（动植物、微生物、无脊椎动物、哺乳类脊椎动物、其他脊椎动物等等，小编亲测，好用才推荐）。无论引物和探针序列的来源如何，对检测方法进行计算机理论和经验验证都非常重要。

人们通常通过 BLAST 或 BiSearch 查询对 RT-qPCR 引物对进行特异性分析。然而，除了特异性评估之外，还需要进行更多的质量控制。我们还应该检查引物退火区是否存在 SNP（这可能会妨碍引物的有效退火或因变异的等位基因而根本无法扩增），并对扩增子的二级结构进行建模（例如使用 UNAFold 软件）。众所周知，与引物退火位点重叠的发夹结构会严重妨碍引物的有效退火，并对 PCR 扩增效率产生负面影响。

在进行计算机进行理论评估后，需要通过实际 RT-qPCR 实验对引物进行经验性验证，使用凝胶电泳检测引物长度，使用 SYBR Green I 检测熔解曲线。需要注意的是，梯度稀释点越多，稀释范围（稀释因子）越宽，PCR 扩增效率的确定就越精确。最佳做法是使用具有代表性的混合样本作为梯度稀释系列的上样模板。

Assay 设计的一个重要方面是选择正确的靶标序列

这在很多情况下并不容易做到，尤其是对于大部分基因都有交替剪接异构体的情况。假如事先不了解这些转录本变体的功能，一个妥当的做法是针对在大多数或所有变体中都有表达的转录本的一部分来设计 assay。专门的剪接变体定量需要特定的工作流程和对研究本体的控制。Vandenbroucke 及其同事发表了一种简单可靠的策略，其关键信息是，准确评估剪接变体需要所谓的绝对或等摩尔（各种剪接变体靶标的摩尔数相同）标准曲线，引物应是检测特异性背后的驱动力（而不是依赖探针）。绝对或等摩尔标准曲线是分子数量已知的曲线；产生这种曲线的有效方法是纯化 PCR 产物或合成单链长寡核苷酸模板，两者都在载体 DNA （10-100 毫微克大肠杆菌或酵母 tRNA）中稀释。

1.4参考基因验证

实验准备阶段的最后一步是选择合适的参考基因进行数据归一化。要认识到，任何基因表达量化结果最终都是由两个变异源组成的：一方面是固有的技术变异或实验诱导变异，另一方面是作为研究现象本身的生物变异。任何归一化策略的根本目的都是尽可能消除技术变异，最终得到真正的生物变化。在 Stephen Bustin 教授组织的第三届伦敦 qPCR 研讨会上，相对3 个或更多有效参考基因进行归一化被认为是最合适、最普遍适用的方法。虽然迄今已有许多算法用于评估候选参考基因的表达稳定性（或作为归一化基因的适宜性），但 geNorm 方法是第一个（http://medgen.ugent.be/genorm），并已成为事实上的标准，被引用超过20,987次（谷歌学术，2023年9月）。

评估参考基因表达稳定性需要先做实验，在每个组织或样本组的10个代表性样本中测量约10个候选参考基因。所选基因代表了不同的生物途径和表达丰度水平。随后将这些基因的表达值导入 geNorm 程序，并根据其表达稳定性进行排序。在随后的分析中，软件能指出需要多少个参考基因才能消除大部分技术变异（这取决于被测基因的表达稳定性和调查样本的异质性）。

通常情况下，需要3到5个基因才能实现准确的归一化。显然，任何记录微小表达变化而不验证参考基因的报告都是不可接受的，因为事实证明，使用单一未经验证的参考基因会导致显著偏差（25% 的结果偏差超过3倍，10%的结果偏差超过6倍）。

除了在具有代表性样本的先行实验中选择稳定表达的参考基因外，评估其在最终实验中的表达稳定性也很重要。在 CFX Maestro 软件中，如果使用多个参考基因进行归一化，则会自动进行表达稳定性计算。这种方法可以对每次实验所需的参考基因进行质量控制。

未完待续，敬请关注“如何让你的 SCI 文章MIQE起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。

下期预告：

《如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来系列2——如何使用 qPCR 技术成功开展基因表达分析实验（下）》，敬请期待~

参

考

资

料

[1] Derveaux S , Vandesompele J , Hellemans J .How to do successful gene expression analysis using real-time PCR, ScienceDirect [J].Methods, 2010, 50(4):227-230.

DOI:10.1016/j.ymeth.2009.11.001.

https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.11.001

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。

【声明】内容源于网络

广州市昊洋贸易有限公司

生物科学信息交流，品牌宣传，产品推广，资源共享

内容 0

粉丝 0

广州市昊洋贸易有限公司生物科学信息交流，品牌宣传，产品推广，资源共享

总阅读0

粉丝0

内容0