如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-4（2）

4.1 引物

图5.引物示意图

大多数检测都是在恒定的 PCR 条件下进行的，包括 95°C 的短暂变性，然后是 60°C 的单一退火和延伸步骤，因为这有利于仪器自动化和使用相同的参数进行不同的检测。不过，由于 PCR 使用的大多数聚合酶在 72℃ 下效果最佳，建议考虑设计引物在较高温度（63±2℃）下杂交的检测方法。这也有助于缩短聚合时间，从而加快完成 PCR 运行所需的时间。由于寡核苷酸价格低廉，因此值得为每个 assay 设计几对引物，并选择 Cq 值最低、引物二聚体量最少（最好没有）的引物对。

图6.典型的 PCR 反应体系

引物性能的关键变量是退火温度（Ta），而不是熔融温度（Tm），因为退火温度（Ta）决定了引物与靶标结合量最大的温度。最佳引物 Ta 必须通过实验确定，因为引物设计程序通常计算的是 Tm，因此许多 protocol 都使用了错误的预测参数 。此外，由于最佳退火温度随缓冲液的不同而变化，使用一种预混合母液得到的结果不一定能在第二种混合母液中重现。即使在最佳退火温度下，也可能出现非特异性扩增，尤其是使用 "校对 "酶时，这不仅是引物二聚体造成的，也是引物对在不匹配位点上、物理上接近造成的。此外，仅仅依靠 BLAST 搜索并不能保证引物的特异性，因为虽然 BLAST 算法能快速返回结果，但由于它不能对产生双链隆起的间隙进行正确评分，因此可能会错过热力学上重要的碱基杂交。

图7.Tm 值，DNA 的双螺旋结构解链一半时的温度

PCR 引物的 Ta 特性差异很大。如果不是在引物的最佳 Ta 值下进行检测，有些 assay 就不够稳健，很快就会失败。

下图展示了扩增不同靶标的三种检测方法的温度曲线，三种引物对的检测结果存在明显差异。Panel A 的assay 结果最佳，最佳 Ta 值范围较宽，其特点是在 59°C–64°C 范围内具有广泛的最佳 Ta 范围和相近的 Cqs（最大 ΔCq=0.53）。Panel B 中的 assay 结果不太稳定，最大 ΔCq 为1.63，而 Panel C 中的 assay 结果在 59°C 和 60°C 之间的最适范围较窄，导致远离最佳范围的 Cqs 明显偏高（ΔCq=8.93）。这与扩增反应的特异性不同，熔融曲线显示的单峰表明assay在测试温度下仍具有特异性（图 D 和 F）。

遗憾的是，我们无法预测哪种引物或引物组合能产生最耐高温、最高效或最特异的检测结果。因此，任何计算机上的理论设计都必须经过实验验证和优化。这需要花费时间、精力和金钱，但却是进行 qPCR 检测不可或缺的一部分，而且实验验证越彻底，后续结果就越有可能是准确的，而不是没有真正生物学意义的、测量误差的产物。

图8.针对真菌 rRNA 基因的

三种检测方法的温度梯度分析

qPCR 检测通常使用正反引物相同量的引物。然而，这通常会导致反应速度减慢，并以随机方式进入平台期，因为模板链的重新退火会逐渐取代引物和探针与模板链的结合，并阻塞聚合酶。当要检测单个细胞中单个拷贝基因的等位基因的特定 DNA 靶标时，这是一个特殊的问题。非对称 PCR 可通过使用不等浓度的引物来规避扩增片段链重新退火的问题。不过，不对称扩增的效率可能要低得多，需要进行大量的优化工作，以确定适当的引物比例、起始材料用量和扩增循环次数，从而为各个模板/靶标组合产生合理产量的产物。

图9.不对称 PCR 的原理示意图

LATE-PCR 解决了这一问题，它使用不等浓度的引物，但考虑了实际引物浓度对引物退火的影响 。它纠正了限制性引物的最佳 Ta 值往往比过量引物的 Ta 值低几度的事实，使非对称 PCR 与对称 PCR 一样高效地进行 。此外，在指数期之后的许多循环中，单链扩增子的生成具有可预测的动力学。这就使得引物退火与通过荧光探针检测产物解偶联成为可能。因此，探针的 Ta 值不再需要高于引物的 Tm 值。这就允许使用低 Tm 探针，因为低 Tm 探针对等位基因的区分度更高，产生的背景更低，并且可以在饱和浓度下使用而不干扰扩增效率。

图10.LATE-PCR 原理示意图

4.2 扩增子

探针检测到的 PCR 扩增子通常较短，因为次优的延伸温度（通常为 60°C）并不总能产生用作进一步扩增模板的完整产物。不过，扩增子大小的选择取决于具体用途，对于某些应用，较长的扩增子效果更好。对于 SYBR Green，人们可能会期望较长的 PCR 扩增子会导致较低的 Cqs，因为它们可以结合更多的 SYBR Green 分子。然而，实际情况并非总是如此，较短的扩增子可能比较长的扩增子记录到较低的 Cqs 。

针对人类肠道病原体艰难梭菌中相同基因的三种检测方法 A、B 和 C 的性能比较就说明了这一点。这些检测方法分别扩增细菌毒素 B（tcdB）基因（NC_009089）的1532-1680、3589-3710和1423-1498 序列（图 10A）。Mfold 分析表明，这三个分别为149、121和 76 bp 的 PCR 扩增子没有明显的二级结构，所有引物结合位点均可用于引物退火（图 10B）。这可能得益于细菌 DNA 中较高的 AT 含量。assay A 的 Cq 为 27.25，而assay B 的 Cq 为26.14，即较短的扩增片段比较长的扩增片段早检测到1.1 个 Cq（图 10C）。两种检测方法的熔融曲线相似，都显示只有一个峰值，B 扩增子在 75 ℃ 时的峰值稍低，而 A 扩增子在 76 ℃ 时的峰值稍高。

图 10. 针对毒素基因 tcdB 的艰难梭菌检测方法比较

与此相反，对扩增子 B 和 C 相比，却得到了预期的结果：B 明显长（121bp）于扩增子 C（76bp），B 的 Cq 为26.14，而 C 的 Cq 为27.87，即长的 PCR 扩增子比短的早检测到1.7个 Cq。一般来说，在 SYBR Green 检测中，过短的扩增片段（<80bp）可能会导致难以区分扩增片段和引物二聚体，并可能导致较晚的 Cq 值。因此，SYBR Green 法测定的扩增子最好比探针法测定的扩增子（60-90）稍长一些（80-150）。此外，SYBR Green 对富含 AT 的 DNA 比富含 GC 的 DNA 有更强的亲和力，因此富含 G-C 的 PCR 扩增子可能比富含 A-T 的 PCR 扩增子获得到更高的 Cq。

熔解曲线分析也并不总是像看起来那样，因为虽然 SYBR Green 在低染料：碱基对比率插入，但在较高比率时，其构象发生变化并与 DNA 小沟相互作用，正是这种相互作用导致荧光显著增加。SYBR Green 与 DNA 结合的一个重要特征是，在 PCR 中，染料：碱基对比率不是恒定的，因为随着更多双链 DNA 的产生，它会随着循环次数而变化。因此，熔解曲线分析可能会受到循环次数和扩增后存在的 DNA 量的影响。

图11.熔解曲线示意图

应始终检查扩增子的二级结构，因为二级结构过多是导致扩增效率降低的重要原因。必须使用实际反应条件检查可能的二级结构，特别是 Ta、盐离子和 Mg2+ 离子的浓度，检查二级结构的最简单方法是使用 Mfold 网站。退火反应的碱基杂交动力学将有利于分子内结合，阻碍引物结合，降低引物效率，从而降低扩增效率。因此，引物的结合区域应该是完全无阻碍的；如果预测表明这些位点存在任何二级结构，则应尽可能移动扩增子。如果避免引物结合位点二级结构的代价是较长的扩增片段，那么这可能是值得付出的代价，特别是随着最新快速试剂的推出。

图11.扩增子二级结构预测图

当然，二级结构只是预测性的，可能还需要考虑扩增子上游或下游的相关联序列，因为它们可能会干扰 PCR 扩增的初始阶段。扩增子的 GC 含量应尽可能接近50%，并应避免包含鸟嘌呤 (G) 重复序列，因为它们可能会阻碍链的完全分离，从而降低扩增效率。

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