近些年来，以抗体药物为代表的蛋白质药物迅速成为了肿瘤靶向和免疫治疗的一类成功的生物制剂。在蛋白质药物研发的生命周期中，包括在生物反应器中细胞代谢，纯化过程中溶液低pH值，冷冻-解冻过程，温度变化和运输分发都会对蛋白的稳定性产生影响。避免或者减少这些物理变性是蛋白质药物开发的重要目的之一，因此稳定性评估是蛋白和抗体药物成药性评价以及生产制剂过程中的必备环节。
稳定性评估通常包括生物活性分析、分子结构和纯度分析（含降解产物的定量检测）以及相关参数的监测（如外观、pH值等），综合以上数据来对样品的热稳定性、聚集性和分子间作用力大小作出评估。除了最常用的通过间接ELISA法对抗体效价和稳定性进行评估外，例如在对热稳定性的评估分析手段上，差示扫描量热法（DSC）是较常用的测量蛋白质热稳定性的方法，进一步发展而来的差示扫描荧光法（DSF）、圆二色（CD）光谱法、动态光散射（DLS）检测技术都朝着高通量、高精度或者对蛋白质水动力学监测等方向改进。
差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry, DSF）又称蛋白热熔解曲线（Protein Thermal Shift, ThermoFluor）法，是RT-PCR技术的一种衍生用法，广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。该方法样品损耗少、通量高、快速、灵敏、操作简便、成本低廉。
DSF的具体原理可以简单的理解为——蛋白有疏水区结构，隐藏在内部，在温度上升时，蛋白的结构会被打开，暴露出疏水区，荧光疏水染料Sypro Orange就可以与该区域进行特异性结合，并被激发荧光。在有特定化合物或配体结合的情况下，蛋白稳定性会上升，表现为熔解温度的上升。
Bio-Rad蛋白热稳定性技术方案
Bio-Rad针对蛋白热稳定性，研发出完备的解决方案，包括仪器、试剂、标准品以及相应分析软件。Opus系列荧光定量PCR仪带有专用检测通道FRET，激发波长为470nm，检测波长570nm，完美匹配Sypro Orange染料，软件操作简便且支持第三方分析；
整体方案能在蛋白样品消耗量最小的情况下，进行蛋白配体结合、蛋白修饰、蛋白突变以及缓冲液条件更换来增加蛋白的热稳定性的研究，对于药物筛选及研发有着低成本、高通量的优势，并且还能用于评估蛋白和其抗体的结合能力，十分适合疫苗研发或者抗体药物研究和生产。
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我们以一个实验案例来看一下，如何用荧光定量PCR仪检测蛋白质热稳定性。本实验研究目标是评估天然的β-木质素在不同pH值和离子强度条件下的热稳定性。
实验流程介绍
01
蛋白样品需要较高的纯度（～75%），化合物的纯度通过 LC-MS 质检；
SYPRO Orange 是目前DSF实验中应用最广泛的染料，方便且高效。此外，也有一些特殊的染料用于特定蛋白的研究，例如 1,8-ANS、2,6-ANS、2,6-TNS、oxazole 系列和 BODIPY、BFC 系列染料探针。
02
根据实验设计把蛋白和配体配置成不同浓度的体系，置于 96 孔板或 384 孔板。缓冲液可以根据实际需要进行更换。需要同时做空白对照（只含 Buffer、Dye 和 Water）和复孔。
03
将上述配置好的体系放入荧光定量 PCR 仪中，激发和发射波长分别调至荧光染料相应波长， 升温速率通常设为 1 ℃/10s，温度变化范围一般从 25 ℃ 到 75 ℃ 或 100 ℃ 不等，每 1～3 ℃ 测定一次荧光强度。
Bio-Rad 的 Opus 系列荧光定量 PCR 仪器无需染料校准，直接采用专用 FRET 通道；以 Bio-Rad Maestro 软件为例，按照如下设置反应程序，进行一次 melt curve 实验。
04
蛋白质的熔解温度（Tm）是通过对记录的热变性数据进行玻尔兹曼（Boltzmann transport equation，BTE）方程转换进行非线性拟合而确定。
Bio-Rad Maestro软件导出的Tm 支持 DMAN_v5.2、MTSA和ThermoQ等第三方软件进行换算！
结果显示：评估了在 pH7.0 下不同离子强度下原生β-木质素的热稳定性。随着 NaCl 浓度的增 加，荧光增加的中点向更高的温度移动，β-木质素的热稳定性也随之提高，用负导数得到的峰 值突出了这一点，推断其原因是因为β-木质素作为一种球蛋白，其溶解度会随着离子强度的增 加而增强。
图1. 熔解变性曲线的一阶导数曲线图
同时评估了不同pH和离子浓度条件下的Tm，可以看出：考虑到蛋白质可溶解的pH值，在pH7.0时获得了最高的蛋白质稳定性！这一结果为后续研究β-木质素单体到三聚体的转变与 pH 及离子浓度的关系提供了重要参考！
结论
蛋白质热漂移实验（DSF）是检测蛋白质热稳定性的简便快速的方法，有助于评估蛋白质配体结合、最佳缓冲液条件或分析蛋白质构象变化等。
参考文献
[1] Kathy Huynh, Carrie L Partch. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci, 2015 Feb 2;79:28.9.1-28.9.14.
[2] Stefano De Benedetti, Camilla Leogrande, Francesco Castagna, Giuditta C Heinzl, Matias Pasquali, Alessandro L Heinzl, Daniela Lupi, Alessio Scarafoni. Thermal Shift Assay as a Tool to Evaluate the Release of Breakdown Peptides from Cowpea β-Vignin during Seed Germination. Molecules, 2022 Jan 3;27(1):277.
* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。