自噬是细胞内重要的分解代谢过程，对维持细胞内环境稳定、应对应激及多种生理病理过程意义重大。准确监测自噬水平对深入理解其机制及相关疾病的病理生理过程至关重要。《Autophagy》期刊更新了第4版的自噬检测方法的使用和解读，全面阐述了自噬的相关机制、检测方法及其在多领域的应用，为科研人员提供了系统的自噬研究指导。自噬检测方法包括以下三类：
基于显微镜的检测方法，如光学显微镜、电子显微镜等，可用于观察自噬相关蛋白的定位和自噬体的形成。
基于生化分析的检测方法，如WB可检测自噬相关蛋白的表达水平和修饰状态，常用的检测指标包括 LC3、p62 等。
基于细胞生物学的检测方法，如细胞存活率、增殖能力等指标评估自噬对细胞的影响。
Atg8家族蛋白是自噬过程中的关键标记物，其包括LC3和GABARAP两个亚家族，它们在不同的自噬过程中有不同的功能。LC3蛋白在自噬体的形成中起作用，而GABARAP亚家族成员则参与自噬体形成的后期阶段。这些蛋白的脂化形式（如LC3-II和GABARAP-II）通常被用作自噬体的标记物，蛋白印迹是检测Atg8家族蛋白的关键方法。在第4版“指南”中，详细的说明了Atg8家族蛋白的Western Blot实验方法和注意事项，总结如下：
新鲜样品应尽快煮沸并跑胶，不可反复进行冻融。LC3-I 比 LC3-II 更不稳定，对冻融和 SDS 样品缓冲液中的降解更敏感。
或者使用三氯乙酸沉淀新鲜细胞匀浆中的蛋白质，以防止样品中可能存在的蛋白酶降解LC3。
Triton X-100 在某些体系中可能无法有效溶解 LC3-II。在 1% SDS 存在下加热有助于检测这种蛋白质脂化形式。
在样品加热之前直接在含有 SDS 的 Laemmli 上样缓冲液中裂解，可以大大提高PVDF 膜上的LC3检测率，尤其是在处理少量细胞时。
脑和脊髓裂解物样品，可使用4-20% 梯度凝胶或 4-12% Bis-Tris 凝胶，充分分离 LC3-I/LC3-II，减少LC3-I 强条带对 LC3-II的干扰。
尽量使用PVDF 膜，其对 LC3-II 的保留效果比NC膜更强，对疏水蛋白的亲和力更高。
LC3-II 水平不应与 LC3-I 进行比较，而应与多种 “管家” 蛋白进行比较。
肌动蛋白和其他 HKP 含量丰富，很容易在凝胶上超载，务必注意其线性范围，不可过曝。
可使用红外荧光二抗检测管家蛋白、考马斯亮蓝或丽春红染色总蛋白的方法替代传统看家蛋白。
可使用Stain-Free免染凝胶染色总细胞蛋白，该方法已被证明是看家蛋白的绝佳替代。
LC3-II和LC3-I两者同时定量更能反映自噬过程的全貌，在衰老的大鼠骨骼肌中，LC3-I 的增加至少与 LC3-II 一样重要。
研究人员应准确报告用于检测 LC3 的抗体的来源和目录号，有助于避免研究之间的差异。
Stain-Free是一种通过特殊免染技术，该技术使用独特的三卤化合物使蛋白质具备直接在凝胶中发荧光的功能，且仅需1min的紫外光激活步骤。能够实现总蛋白归一法，总蛋白归一法相比于传统内参更适合让您的实验结果更加精准。
完整的《第4版自噬实验指南》请参考文末参考文献。要获得更详细的Stain-Free技术信息或实验方案，我们当地的技术支持或合作伙伴会非常乐意与您联系。请填写二维码表单留下您的联系方式。
参
考
文
献
* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。