反转录（RT）发生在使用qPCR 步骤中检测 cDNA 之前，使用反转录酶和 dNTPs 将 RNA 转化为 cDNA 的过程，反转录是 qRT-PCR 中误差来源的主要原因，因此，优化 RT 步骤可改善 qPCR 结果。
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4、反转录效率
4.1概述
理想情况下，每个转录靶标 RNA 或 mRNA 分子都将被转化为一个对应的 cDNA 分子，或者至少所有靶标 RNA 都将以相同的效率被转录。然而现实中，RT 效率是可变化的，但很少有人关注这种可变性的实际影响。所以以下两种认知是错误的：
RT 反应中的所有 RNA/mRNA 都会转化为 cDNA。
所有转录本都以1:1的比例或与起始 RNA 浓度成比例的转化。
很多研究对这些假设都进行了研究，发现两步 RT 过程是多变的，具体取决于样本质量、引物策略、 RNA 浓度、RT 酶、缓冲液成分和 protocol。
比如 Bustin 等人在2015年发表的《Variability of the Reverse Transcription Step: Practical Implications》研究中使用商用反转录酶和不同质量和浓度的 RNA 样品对 RT 步骤的可重复性进行了研究。他们使用单重 SYBR Green I 或双重探针 RT-qPCR 对多个 mRNA 靶标进行了定量，后者用于计算在同一个 qPCR 检测中 mRNA 靶标之间的 Cq 相关性。
以反转录酶相关变异性为例
针对 GAPDH #1 的 RT-qPCR 结果显示，用 iScript、Vilo、Grandscript、Readyscript、Primescript 和 Tetro 反转录的10个重复样本的 ΔCqs 在0.4至1.74之间，所以不同反转录酶或 RT 缓冲液，即使同一个样本，其基因表达水平也会发生很大变化。
Bustin 等人的研究表明， RT 效率与 RT 酶、样本、RNA 浓度和检测方法 protocol 有关，可能导致来自同一样本的 mRNA 之间的相关性发生变化。这导致相对 mRNA 表达水平通常相差2至3倍，甚至更高。因此RT 步骤的变异性很大，涉及 cDNA 合成的结果报告必须尽可能透明和完整，并包括反转录的 RNA 量、引物策略、酶类型、体积、温度和反转录步骤的持续时间。该研究建议反转录步骤应一式两份或三份。
4.2 RT 效率的定义
RT 效率是指 RT 酶将 RNA 分子数量表示为 cDNA 的准确程度。例如，如果特定样本中含有1000个给定基因的 RNA 转录本，那么效率为100%的 RT 反应将生成正好1000个 cDNA 模板。遗憾的是，许多 RT 酶对高拷贝或低拷贝转录本的准确表达存在偏差，这会影响表达基因的定量。RT 效率是通过分析 RNA 的系列稀释液（通常为 1µg），然后进行多次 RT 反应和 qPCR 来确定的。如果希望获得准确的相对或绝对定量，则必须对 RT 和 qPCR 检测进行验证，以获得可接受的反应效率。
4.3 RT 效率的测定方法
通过对 RNA 样本进行梯度稀释后再进行各个 cDNA 样本的合成，通过构建标准曲线来明确 RT 效率，可通过梯度实验明确 RT 的动态范围和重复性，以选择合适的试剂和反应条件。对于难扩增的基因和低丰度的基因，采用具有更大的动态检测范围的反转录试剂更为适合。
1.制备 RNA 梯度稀释系列
制备 cDNA 合成反应②时，需要对单个 RNA 或 RNA pool 样品进行系列稀释①。需要足够量的 RNA，因此可能需要相应的调整浓度和体积。
2.制备 cDNA 合成反应②
可使用 20µl 反应液进行 RT。如图所示，将 RNA 分别转移到相对应的反应管中。重复将 RNA 转移到其余反应管中。
3.制备 cDNA 梯度稀释系列③
对②中浓度最高的 cDNA 进行梯度稀释，得到与②相似的梯度稀释系列。
4.以 cDNA 为模板进行 qPCR 反应
以 cDNA 为模板进行 qPCR 反应，得到 Cq 值，根据浓度的对数与 Cq 值的关系制作标准曲线，如下图显示，RT 具有良好的线性关系、较宽的动态范围，所以 RT 效率极佳。
提示：
始终使用同一台 qPCR 仪进行比较，以确保整个评估过程中的一致性。
建议使用10倍稀释系列，以覆盖最大对数的动态范围；但根据所评估基因的表达水平和总 RNA，可将稀释系列减少到5倍。
起始 RNA 上样 浓度可根据可用总 RNA 浓度进行调整。
4.3反转录效率一致性的重要性？
不管靶标基因的丰度如何、起始的 RNA input 量如何，反转录的效率如果保持一致，则可确保 cDNA 的差异能够真实反映 RNA 的基因表达量的差异，不影响基因表达的差异。
反转录效率一致性可以通过预实验来判定（如上4.2所述），Bio-Rad 严格控制效率的一致性，每个批次的 RT 试剂盒都需要通过测试，其可在 Bio-Rad 官网上可以查询到 certificate of analysis 证书。
5.结论
反转录是 RT-qPCR 和世界各地实验室常规进行的广泛应用中的一个关键步骤。然而，尽管反转录在分子生物学研究中居于核心地位，但作为决定结果整体数据质量和有效性的一个因素，反转录步骤的关键性可能未得到足够重视。必须仔细考虑 RNA 模板质量和实验设计细节，清楚了解 RT 效率和 RT 偏差程度等特征。
MIQE 指南（发表 Real-Time PCR 实验所需的最低限度信息）提供了一个框架，如果得到遵守，就能确保关键的实验设计和性能细节得到记录。MIQE 指南除了指导研究人员进行更有效的实验外，还促进了各实验室之间的一致性，并有助于对科学文献中报告的实验结果进行适当而有效的评估。随着反转录领域中新酶工具和新应用的不断创新发展，遵守这些指南变得更加必要。
反转录实验可能会受到多种因素的影响，包括模板、引物、酶/缓冲液以及反应条件等等，所以涉及 cDNA 合成的结果报告必须尽可能透明和完整，包括反转录 RNA 的量、引物策略、酶类型、体积、温度和反转录步骤的持续时间等。
由于 RT 如此多变，保持尽可能多的恒定条件非常重要。对于两步 RT 反应，有必要以相同的上量 RNA 浓度，保持恒定的引物条件、RT 酶和缓冲液成分，最好在相同的 RNA 浓度下进行 2-3 次重复，以保障实验结果的准确性。当无法确定恒定的上量浓度时，建议采用一步法，并加入聚乙二醇（PEG）等载体以提高反应性能 ，或选择经过验证可产生线性反应的商业试剂盒。
高效稳定反转录 RT 的实用技巧：
高质量的 RNA 能带来重复性最好、最稳健的结果
尝试不同的 RT 酶和引物策略组合，以找到最理想的结果
尝试 Oligo-dT 和随机引物混合的引物策略
更高的温度可有助于打开 RNA 二级结构，有利于合成全长 cDNA
通常基因特异性引物对低表达者效果更好，但这可能与序列有关
RT 需要确保相同的实验条件，特别注意避免移液带来的误差
未完待续
敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。
下期预告：
《实验设计时的2个注意事项》，敬请期待~
参
考
资
料
[1] MIQE qPCR & dPCR How to apply the MIQE guidelines - a visual, interactive and practical qPCR & dPCR guide 5th Edition (20th February 2022)
[2]T Stephen Bustin, Harvinder S Dhillon, Sara Kirvell, Christina Greenwood, Michael Parker, Gregory L Shipley, Tania Nolan, Variability of the Reverse Transcription Step: Practical Implications, Clinical Chemistry, Volume 61, Issue 1, 1 January 2015, Pages 202–212, https://doi.org/10.1373/clinchem.2014.230615
[3] 《RT-PCR Optimization Strategies》 by Reiter and Pfaffl
* BIO-RAD 是 BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。