我们在《如何使用 qPCR 技术成功的开展基因表达分析实验-上》中提到正式开展实验前需要进行设计 qPCR Assay，并对其进行质量控制，也即优化和验证。接上篇，小编将为大家介绍如何进行 qPCR Assay 的优化和验证。
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一、什么是 Assay 的优化和验证？
1.1 Assay 优化
这是一个确定理想 PCR 条件的过程，在此条件下进行检测，可最大限度的提高灵敏度和特异性。这些问题可能包括 "我应该使用什么样的热循环条件？"或 "PCR 母液中应该加入什么成分？"等。
优化 Assay 可以帮助你：
提高特异性：消除非特异性扩增，如引物二聚体
提高灵敏度：获得更小的 Ct 值，检测更低的浓度
提高重现性：降低重复变异性，提高扩增效率
Assay 优化可提高 Assay 的稳健性，最大程度的减少 Assay 的变异性。
1.2 Assay 验证
通过实验来证明使用某个特定的 Assay 可以检测量化的靶标核酸，通过实验来证明在研究中使用检测方法的合理性。验证可以帮助回答审稿人可能提出的问题，如 "你怎么知道你只对你感兴趣的基因进行了量化，是否存在非特异性扩增？或者 "你怎么知道你的相对数量是准确的？验证 Assay 可轻松避免或了解未来实验中可能出现的意外结果。
引物和探针的特异性（熔解曲线、阴性对照）
Assay 的线性工作范围和灵敏度（阳性对照、标准曲线）
实验的重复性 （重复、数据统计分析）
“
小结
可以把 Assay 优化看作是在正式开始实验前采取的必要步骤，以确保能在正式实验时使用。换句话说，更重要的是，要确保你的 Assay 是在灵敏度和特异性达到理想平衡的条件下进行。因此，无论是自己设计的 Assay、使用在出版物上找到的 Assay，还是购买商业化的 Assay，都应该通过验证来确保获得的数据准确可靠。
此外，逆转录是 qRT-PCR 错误的主要来源之一，因此，优化 RT 步骤可改善 qPCR 结果，关于 RT 关键步骤和注意事项，我们将在后续系列文章中介绍。
二、为什么要进行 Assay 的优化和验证
经过适当验证的引物对于决定 PCR 反应的特异性、灵敏度和稳健性至关重要 。虽然 PCR 检测几乎总能得到结果，但这并不等于得到了正确的结果，无论是使用终点检测法检测病原体或基因突变的存在与否，还是使用 qPCR 法准确量化 RNA 拷贝数或相对表达量。实际上，PCR 并不像许多人认为的那样强大，需要考虑 DNA 空间结构折叠、碱基匹配与错配等。
只有经过精心设计、验证和优化的可靠 qPCR 检测方法得出的 qPCR 数据才是可靠的。这一过程需要一系列的 Assay 设计程序，目的是生成最佳的引物/探针/扩增子组合，以实现核酸的精确检测，并尽量减少对 PCR 后分析的工作量。
无论试剂供应商如何承诺，都不能轻易放弃这一关键策略，而轻易的选择预先设计的引物和探针、预混合母液或某些 PCR 添加剂。在实验开始时进行缜密的 Assay 设计和认真的优化、验证，可以在解释数据时避免大量的痛苦工作。在发表 qPCR 结果时，必须报告所有相关的实验条件和 Assay 特性，因为这将使其他研究人员能够重现结果，并对 qPCR 数据做出更可靠、更明确的解释。
三、qPCR Assay 的优化
优化 PCR 反应条件可以减少引物二聚体的形成，提高扩增效率和特异性。
3.1摸索最佳退火温度
如另外前文所述，引物的 Tm 和 PCR 反应最优的 Ta 值可能是不同的。因此有必要利用温度梯度功能优化退火温度，温度梯度的目的是在不产生次级产物或引物二聚体的情况下，获得能产生最低 Cq 值的扩增曲线的温度范围，注意可能是一个较宽或较窄的温度范围。
在可能的情况下，建议在典型的 qPCR 实验中对不同引物使用相同的退火温度，这样可以在在同一反应板上运行多个引物对。
使用具有热梯度功能的 qPCR 仪器可以轻松确定检测的最佳退火温度，所有 Bio-Rad real-time PCR 检测系统都具有梯度功能。温度梯度可同时测试一系列温度，因此可以在一次实验中优化退火温度。
在最佳退火温度下，优化后的 PCR Assay 性能指标还要符合下列标准：
高扩增效率 (90-110%)
线性标准曲线（R2 > 0.980）
实验样本之间精度高
重复实验之间的一致性
无引物二聚体
动态范围广
3.2 引物和探针的浓度
对引物和探针浓度的优化可确保最灵敏、最高效的检测，有时这是一个可以优化的变量。预混液厂家通常会有一个推荐的浓度范围，因此请务必注意该范围。此外，请记住，加入浓度过高的引物有时会导致引物二聚体的形成，而浓度过低则会降低 PCR 扩增效率。
具体案例请查看 《qPCR assay的设计》系列推文。
3.3 选择合适的 qPCR 预混液
选择或优化 qPCR 预混液，需要考虑的问题包括："我想使用 SYBR Green 还是探针检测？或者 "我应该使用标准酶还是高级 Taq 聚合酶？如果你的样品纯度较低，或者靶标的 GC 含量很高，你可能需要考虑使用更强的聚合酶，如 Bio-Rad 的 SsoAdvanced预混液。另外，请记住，如果要进行多重反应，同时运行多个 PCR 反应需要更多的资源，有专门用于多重反应的试剂。
优化/验证 Assay时显示的结果很可能就是在实际实验中呈现的结果，因此，应该一开始就选择和测试合适的试剂，即使在测试过程中遇到数量少、质量低的样品，也能提供所需的稳定性能。
下图1的结果显示了使用优化引物/预混合母液组合的效果。该 Assay 以真菌 DNA 为靶标，正向和反向引物与 PCR 扩增片段中无二级结构的区域结合。有两种正向引物和两种反向引物，当测试所有可能的组合时，可以明显看出，在混合母液 A 中，CA-F/CA-RB 组合是最差的组合，因为 Cq 转化成的检测灵敏度比使用 CA-R 引物的检测灵敏度低8到25倍。相比之下，只有 CA-F/CA-R 组合在使用混合母液 B 时效果最佳，其他三种组合的 Cq 值相似，但更高。使用两种混合母液得到的熔解曲线略有不同，这并不意外，因为它们含有不同的成分。
图 1. 不同预混合液对扩增的影响
A. 针对真菌 DNA 的 qPCR 检测使用了两套正向和反向引物，它们主要在3′端不同。PCR 扩增子在引物结合位点没有二级结构问题。
B. 使用预混合母液 A 时，引物组合之间的最大 ΔCq 为 4.64，相当于灵敏度相差 25 倍。使用 CA-R 的检测记录的 Cq 最低，而使用 CA-RB 的检测得到的 Cq 较高。当使用混合母液 B 时，引物组合之间的最大 ΔCq 为 2.98，相当于灵敏度相差 8 倍。使用 CA-F/CA-R 的检测记录的 Cq 最低，其他三种大致相当。
C. 预混合母液 A（绿色）和 B（蓝色）的熔解曲线显示，所有引物组合的检测特异性相同。
3.4 多重 qPCR 检测优化
如果要进行多重 qPCR 检测，则应先验证和优化单个检测，然后再将它们组合到多重检测中。
如果多重反应没有优化，扩增效率较高或扩增量较多的目标物可能会抑制扩增效率较低或扩增量较少的目标产物。出现这种情况的原因是，DNA 聚合酶、dNTPs 和 MgCl2 等反应成分在后面的循环中变得有限或稀少，从而影响了效率较低或含量较少的目标物的扩增，往期文章也有描述。在多重 qPCR 检测中，靶标扩增受抑制会导致其 Cq 相对于单重检测延后。优化多重反应的一种方法是依次增加 DNA 聚合酶、dNTPs 和 MgCl2 的浓度。
此外，有时候 DNA/cDNA 的上样量也需要优化，以确保最高灵敏度、最少 PCR 抑制物，请参考往期推文。
qPCR 检测的精确度和可靠性取决于 PCR 反应各个方面的严格优化。彻底优化 PCR 方案、试剂、仪器和分析方法是获得有效、可重复、特异性和最高灵敏度结果的关键前提。在某些情况下，Assay 可能不需要太多的优化，但对于具有挑战性的 qPCR 检测，例如精确定量核酸数量（DNA 或 RNA）的微小差异，以良好的灵敏度/特异性区分可靠的检测病原体、基因多态性或突变的情况，则必须优化。
图2所示的扩增图和标准曲线说明了典型的优化 qPCR Assay。它在从1×108拷贝一直到单拷贝的宽动态范围内显示出良好的线性。设计良好的检测方法具有宽广的动态范围，这是 qPCR 检测方法的主要特点之一，可确保准确量化差异巨大的靶标拷贝数。
图2. 精心设计的 qPCR 检测的线性度。使用 Asp-F 和 R 引物对目标 DNA 进行十倍序列稀释扩增。四个重复序列产生的变异性随着靶标拷贝数的减少而增加，直到标称的单拷贝靶标在4/5个重复序列中不能产生 Cq。
如果检测方法设计合理、优化得当，那么使用相同的预混合母液检测相同的靶标基因或基因组，但扩增靶标基因或基因组上不同区域的不同 Assay，应该可以得到相似的结果。这意味着，如果两个实验室使用优化的检测方法扩增相同的 mRNA，其结果应该是相同的。图3中的例子很好地说明了这一点。图 3A 显示了扩增缺氧诱导因子 1 alpha 亚基转录本变体 2 基因（NM_181054）第 5/6 号外显子（A）或第 7/8 号外显子（B）的检测位置。二级结构分析表明引物退火位点没有二级结构（图 3B）。图 3C 中的扩增图是在 Bio-Rad CFX 上从 55 °C 到 65 °C 的温度梯度下得到的，证实这两种检测方法性能相当且稳定，可得到相当的 Cq，在熔解曲线分析中可检测到单个峰值。标准曲线也相似，扩增效率相当（图 3D）。
图 3. 针对同一基因 HIF-1α (NM_181054.2) 的两种优化 qPCR Assay 的比较，退火在 55°C-65°C 的温度梯度下进行。
A. 基因的外显子/内含子结构，Assay1 扩增5号和6号外显子的序列，Assay2 扩增7号和8号外显子的序列。
B. 引物结合位点没有二级结构问题。
C. 两种检测方法都很稳健，55°C-65°C 梯温度度产生的 Cq 分别为 24.68±0.07 和 24.32±0.12。熔解曲线分析显示只有一个峰。
D. 标准曲线具有可比性，显示出至少超过五个数量级的线性。
未完待续
敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会你如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。
下期预告：
《qPCR Assay 的设计及验证（中）》，敬请期待~
参
考
资
料
[1] https://www.bio-rad.com/en-cn/applications-technologies/qpcr-assay-design-optimization?ID=LUSO7RIVK
* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。