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MIQE 宗旨
MIQE 是一套基于荧光定量 PCR 技术的指南，提出了评估 RT-PCR（qPCR）实验结果和文章发表所需的最低标准。主要是以提高结果的可靠性和实验的可重复性为目标，帮助实验者确保科学文献的完整性，提高不同实验室之间结果的一致性，增加实验的透明度。
MIQE 是国际上最新推出的一套指南，就评价RT-PCR（qPCR）实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准（即那些必需的实验信息），不仅面向作者，同时审核人和编辑也应该参考该指南。MIQE 指南是文章投稿时需要同时提交的一个实验清单（🔗文末扫码以获得 MIQE 指南原文及Checklist）。通过论文作者提供相关的实验相条件和实验特点，审稿人可以评价实验所用方法的可靠性，另外提供详细的实验所用试剂、序列和分析方法，以保证其他研究人员可以利用这些信息进重现实验结果，qPCR 实验必须报告这些信息，以确保其相关性、准确性、正确解释和可重复性。MIQE 的细节应当作为在线发表的一个附件或者简要形式同时发表。
总之遵从 MIQE 指南可以更好进行实验操作，并得到更可靠和更明确的 PCR 实验结果。
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术语
为确保用词更为规范，首先定义几个术语以确保使用同一种标准化词语。
实时定量 PCR 的简写
2.1
建议实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR) 应当简写为 qPCR，反转录 PCR (reverse transcription–qPCR) 应当简写为 RT-qPCR。用 RT-PCR 简写表示 qPCR 可能引起混乱，并且与传统反转录 PCR 的意义不符。
内参基因
2.2
内参基因应当指的是参照基因 (reference genes)，而不是管家基因 (housekeeping genes)。
TaqMan 探针
2.3
TaqMan 探针应指的是水解探针 (hydrolysis probes)。
FRET probe
2.4
FRET probe (fluorescence resonance energy transfer probe, 荧光共振能量转移探针)指的是一种通用的作用机制，在2个荧光基团的电子激发状态之间的相互作用的基础上进行发光/淬火。LightCycler 型探针指的是双杂交探针 (dual hybridization probes) 。
定量 quantification
2.5
牛津英语词典只列出了定量 (quantification)，非定量 (non-quantification)，因 quantification 是恰当的。
Cq
2.6
现在文献中使用的阈值循环 (threshold cycle, Ct)，交点 (crossing point, Cp) 和分支点 (take-off point, TOP) 与 PCR 反应循环中的术语不一致。实际上在 qPCR 仪器上，这些术语指的是相同的值，只是不同仪器厂家为了竟争而赋予了其特定定义，不具有准确性和清晰性。根据实时定量 PCR 的标记语言的数据标准 (www.rdml.org)，建议同一使用定量循环 (quantification cycle,简称 Cq) 这个术语。
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概念（技术指标）
为了解释指南，我们有必要定义与 qPCR 实验有关的一些关键性技术指标
分析敏感度(Analytical sensitivity)
3.1
分析灵敏度是指单次分析中能够准确测定的样本的最小拷贝数(浓度)，而临床灵敏度是指患有特定疾病的个人在检测该疾病时得到阳性结果的概率。通常情况下,灵敏度以检测限 (LOD) 表示,指特定的分析程序在某一置信水平(通常采用 95% 的概率值)下检测到的最低样本浓度。理论上最灵敏的 LOD 可能是每次 PCR 检测3个拷贝，假设为泊松分布，在95% 的置信水平下单次 PCR 至少有1个拷贝,即可达到单拷贝检测。实验程序通常包括样品处理过程( 如“提取”),必要时也包括反转录。如果将这些过程的体积变化和 PCR 扩增效率计算在内,理论上最灵敏的检测限可以用实验相关的单位表示,如每纳克组织中的拷贝数。低于理论上检测限可能值的实验结果绝不能报告。同时应该注意结果为“0”是毫无意义的和误导的。因为在qPCR 分析中通过对 Cq 取对数来计算 LOD,当模板浓度为零时 Cq 是没有意义的。LOD 适当的测定方法和模型是 qPCR 分析下一步研究的重点。
分析特异性
3.2
分析特异性是指 qPCR 分析在样本中有其他物质存在时只检测目标序列的能力。诊断特异性是指未患某种疾病的个人在检测该疾病时得到阴性结果的概率。
准确度
3.3
准确度指实验测定浓度与实际浓度的差异,以差异倍数和拷贝数的估计值表示。
重复性
3.4
重复性(短期精密度或批内变异)指的是同一方法分析同一样本的精密度和稳固性(robustness)。可通过 SD 描述 Cq 的变异,SD 或 C 表示拷贝数或浓度的变异。然而,多个 Cq 间的变异不能通过 CV 表示。
重现性：
3.5
重现性（长期精密度或批间方差)指批间结果或不同实验室间结果的变异,通常以拷贝数或浓度的 SD 或 CV 表示。由于不同批次下的 Cq 值受固有批间变异的影响,因此报告批间 Cq 值是不恰当的。
写在最后
Tips：
”
RT-qPCR 实验产生的表达量的变异可能并不仅仅是因为实验程序的变异，而是由于不同数据处理算法的校正引起的，每个算法都有一个相应的数据假设。因此虽然 qPCR 是试金石或者金标准，但在实际中这个标准是可变的，报告结果需要充分考虑到分析和解释复杂性。
未完待续，敬请关注“重读经典，MIQE 指南解读系列”，下期见~
参
考
资
料
* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。