续前文：
4
两个大应用：
科学研究、临床诊断
qPCR 技术主要有两方面应用，即研究和诊断在研究领域。
研究领域所分析的样本通常具有以下特点：来源广泛、通量较低和样品类型多。目前需要解决的主要问题是方法的分析灵敏度和特异性，分析灵敏度表示方法能够检测到的最低靶标拷贝数，特异性指无模板质控品 (NTCs) 是否能得到可靠的阴性结果。
相反，诊断分析的样本特征有：靶标数量有限、高通量和样本类型少。虽然研究领域存在的问题也同样适用于诊断分析，但临床诊断测定还有其他一些要求：
01
分析的敏感性和特异性，分别指当靶标存在时方法测定结果为阳性
的概率，和当靶标不存在时测定得到阴性结果的概率；
02
实验室内和室间的准确度和精确度往往通过室间质评程序进行监测；
03
结果报告的标准化、样本是否进行重复测定、对假阳性和假阴性数
据的分辨率及使用相同和不同的技术的多个实验室测定结果之间的
相似度。
到目前为止只有两个实验室间的比较研究被发表，这两个研究都强调了需要将 qPCR 诊断方法标准化。欧盟第七框架计划：SPIDIA( 体外诊断通用的分析前工具和程序的标准化和改进计划，见网站 http：//www.spidia.eu) 里也包含一个实验室间比对计划。
5
样本的采集、处理和制备
样品采集过程是造成实验变异的第一个潜在来源，特别是当待测靶标为 RNA 时，因为 mRNA 很容易受到样本收集和处理方法的影响。有报道称将新鲜组织保存在冰块中对 RNA 的质量和浓度没有太大影响，这种假设对某些 mRNA 和组织可能是可行的，但未必普遍适用，最好谨慎些。因此，详细地报告组织样本的采集来源以及是否得到立即处理是很重要的。如果样本没有立即处理，则需要报告其保存的时间和保存条件。
立秋时节
样本的简单描述也很重要。例如，肿瘤活检的显微镜检查可提供活检标本中肿瘤细胞组成的百分比，这些信息应该记录并报告。
立秋时节
核酸提取是第二个关键步骤。提取效率取决于以下几个方面：充分的组织匀浆化、样品类型(例如：体内组织还是对数生长期的培养细胞)靶组织密度、生理状态(例如：健康、癌症或坏死)、遗传引物的复杂性以及处理的生物样本的数量。因此，必须要提供核酸提取方法的细节、用于测定核酸浓度的方法及相应的质量评价方法。这些细节对于从新鲜冰冻且经过激光捕获显微切割的活检标本中提取的 RNA 特别重要，因为组织制备过程中的变异对 RNA 的产量和质量都具有重大影响。
立秋时节
6
核酸质量控制
RNA 样本：
6.1
比较不同的样本时，应保证各样本中含有大致相同量的 RNA，因此需要对所提取的 RNA 进行定量。常用的定量程序(仪器厂商)包括：分光光度法、微流控分析、毛细管凝胶电泳和荧光染料检测。由于不同的方法产生不同的结果，因此直接比较不同方法的测定结果是很不科学的。建议使用荧光 RNA 结合染料(如 RiboGreen)定量 RNA，此法在检测低浓度靶标时表现出最佳性能。任何情况下都建议仅使用单一方法测定所有样本并报告相关信息。检测和报告全基因组 DNA 的污染程度，并记录能够耐受的这些污染的临界值标准也是非常重要的。另外还应重点报告 RNA 样品是否已经过 RNA 酶处理(包括酶的类型及反应条件)，并报告每个核酸靶标在阳性质控品和无反转录质控品下获得 Cq 值比较的结果。
立秋时节
此外，还必须提供 RNA 模板的质量评价结果。除非提取的总 RNA 量太低以至于不允许进行质量评价。但产生这种特殊情况是有条件的：从单细胞血浆、其他无细胞体液、一些激光捕获样品或澄清组织培养基中提取 RNA，或提取操作和 RT-qPCR 测定是在一个连续的、单管实验中完成。还需要报告的关键信息包括 RNA 的数量、RNA 完整度、不存在反转录或 PCR 抑制剂。值得注意的是 RNA 在体内的降解非常明显，这是 mRNA 对环境刺激而进行的自然调节。研究人员尚不能控制 RNA 的降解，其表现之一是即使高质量的 RNA 样品也会显示出不同的 mRNA 降解差异。
立秋时节
吸光度比值可以评估 RNA 纯度，因为 DNA 或残留苯酚会改变吸光度比值。A260/A280 吸收度比值必须在中性 pH 的缓冲盐条件下测定，但如果进行核酸定量分析，特别是测定细胞mRNA浓度微小 (< 10 倍)的差异时，单单提供以上测量信息是远远不够的。另外至少应该提供凝胶电泳的证据，如果可以，最好提供 rRNA 的微流控分析结果或参考基因/靶基因的 3'：5' 的 RNA 完整度检测结果。
立秋时节
使用 Bioanalyzer 或 Experion 系统计算 RNA 完整度或 RNA 质量指标数值的优势在于，这种测定提供了 RNA 样品总体状况的定量信息。但需要注意的是不要奢望这些与 rRNA 质量有关的数字作为 RNA 质量评估的绝对指标。
使用 3'：5' 测定法要求两种测定方法的 PCR 扩增效率几乎相同，且不受不同抑制作用的影响。这种检测方法还需要建立一个阈值标准，以确定足以产生可靠结果的 RNA 质量。理想情况下，测定方法应该以一组“完整性参考基因”为靶标，可能没有内含子，3'：5' 的阈值比约为 0.2-5。显然，我们需要进一步的研究以建立一个普遍适用的、符合成本效益的、简便的实验程序来评价 RNA 的完整度。
建议使用稀释的样本或常用的抑制物检测方法如 SPUD 法检查反转录活性或 PCR 的抑制。如果 RNA 样本发生部分降解，这个信息一定要记录并报告，这是至关重要的，因为这样可能会使检测方法在低浓度转录水平的灵敏度降低，而且由于降解引起的转录水平的相对差异可能会导致靶标比值结果不正确。
DNA 样本：
6.2
一般情况下，DNA 不会产生很大的降解问题。然而，在法医学领域，DNA 降解程度的评估是一项很重要的工作，例如在犯罪现场恶劣的环境条件下或大规模灾害或涉及多个失踪人员的案件中，DNA 的化学结构可能已经发生降解。小规模 PCR 扩增分析有助于最大限度的减少检测有关的问题。目前已开发出可对 DNA 质量进行定量测量的方法，我们应该考虑将这些方法用于上述的特定目的。
立秋时节
抑制剂的存在会给测定结果带来变异，因此文章中必须说明是否存在抑制剂，以确保不影响 DNA 的测定结果，如病原体检测和相应的定量。在样本中加入阳性质控品的方法可用于检测抑制作用，但不同 PCR 反应可能会受到不同程度的抑制，这些抑制剂往往是在核酸提取物中与 DNA 共纯化的物质。因此，常规实验中最好将核酸样本稀释，以证明观察到的 Cq 或拷贝数的减少与预期结果是一致的，并报告这些数据。
写在最后
Tips：
”
未完待续，敬请关注“重读经典，MIQE 指南解读系列”，下期见~
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考
资
料