续前文：
《重读经典，MIQE指南解读系列-5 反转录和 qPCR 》
9
数据分析
数据分析包括原始数据的检查、数据质量和可靠性的评价和结果报告的生成。前文已经描述了多种数据收集和处理的策略，某项系统性评价结果显示，不同 qPCR 数据分析方法的性能显著不同。
立秋时节
应该提供数据分析方法和置信限评估的详细信息，及分析软件的性能指标。必须详细说明离群值的确定方法和数据的处理方法。精密度分析要求提供用于评价变异(如95%可信区间)的统计方法并提供相应浓度或 Cq 值。这些信息尽可能包括重复性和重现性数据。如前所述，提供 Cq 值的变异系数 CV 是不合适的，因为计算得到的 Cq 值的变异总是比拷贝数的 CV 值低，会产生误导。另外必须提供准确度的评价方法，包括所报告的组间差异的显著性等。
归一化：
9.1
归一化是可靠的 qPCR 检测的重要组成部分，因为这一过程可控制提取效率、反转录和扩增效率的差异，从而对不同样本的 mRNA 浓度进行比较。
使用参考基因作为内部对照是对细胞 mRNA 数据进行归一化处理的最常用方法。尽管使用参考基因被认为是最合适的归一化策略，但对于特定的组织、细胞形式及实验设计而言，参考基因的使用必须经过实验验证。不幸的是，虽然操作人员越来越意识到系统验证的重要性以及使用不适合的参考基因潜在的误导效应，但这些问题仍然被忽视。因此，许多分子生物学分析仍然包含着经过较差的归一化的 qPCR 数据。
立秋时节
归一化要求报告靶标基因相对于参考基因 mRNA 浓度的比值，参考基因的 mRNA 应该得到稳定表达，其丰度应该与样本中 mRNA 的总量有较强的相关性。
用单一参考基因进行归一化是不合理的，除非研究者能提供证据证明在所述的实验条件下没有表达差异。参考基因的选择优化及最佳数量必须通过实验测定，此项研究已有文献报道。
变异：
9.2
生物系统的固有变异可能达到或超过实验的组间差异。当使用较多生物学样本以增加实验的统计学显著性时，常可以观察到这种变异。尽管众多生物样本之间的差异可能很大，但足够多的样本量使较小的实验差异被辨别出来。最近有文献提供了处理该类数据的成功例子，内容包含当数据显示有很高的生物变异时，应如何挽救这些有生物学意义的数据。很多因素可以产生实验变异，并且影响达到特定统计学效能所需要的生物样本个数。因此，为了确定产生有效结论所需的样本个数，统计效能的分析非常有用。
质量分析：
9.3
若 PCR 仅用来检测是否存在某个特定核酸模板，而不进行准确定量，则被称为定性 PCR，此技术广泛应用于病原体诊断。定性还是定量 PCR 的分类问题主要取决于 PCR 技术是否对低的灵敏度有要求，有要求的是定性 PCR，相反则是定量 PCR。因此即使是定性 PCR 分析，也需要提供其分析性能的详细信息，尤其应包括7.4.2和7.4.3中涉及的内容。
总结
Tips：
”
目前，关于 qPCR 和 RT-qPCR 分析方法质量保证过程的重要性已被广泛认可。qPCR 和传统 PCR 分析的主要区别在于，前者要求能更准确地定量靶核苷酸。我们必须充分认识这一区别，并且认识到传统 PCR分析不能直接转化为qPCR。MIQE 指南提供了一张发表 qPCR 研究报告所需的要素清单，如前所述。标记为重要 (E) 的项目是必须提供的，以方便评阅人员评估研究工作并允许其他人进行重复。标记为理想 (D) 的项目也很重要，应尽可能包括在内，但未必适用于所有情况。
立秋时节
当然，运用常识也很重要：在初步筛选针对数百个靶点的表达进行特征时，没有必要遵守检查表上的所有项目。但是，一旦确定了一组较为有限的靶标（少于20个），就应该按照检查表的详细说明来描述检测性能。详细信息参考 http：//www.rdmlorg/miqe/。
总之，该指南主要有3个目的：
”
使作者能够设计和报告更有价值的 qPCR 实验。
使评阅人员和编辑按照相应的标准来评价所提交的文稿的技术质量。
使读者更容易重复按照该指南发表的实验研究
因此，若指南要求的技术得到广泛应用，研究数据将更加统一、可比，最终更加可靠。
“重读经典，MIQE 指南解读系列”到此完结，之后请大家继续关注姊妹篇“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”，详细介绍如何基于 MIQE 指南设计、实施 qPCR 实验并发表符合 MIQE 指南要求的数据，让您的 qPCR 实验细节和数据也 MIQE 起来~
参
考
资
料
为方便大家学习 MIQE 指南，本解读系列的前5篇链接如下，欢迎大家点击阅读👇👇👇
往期推荐
* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。
* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。