如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-2（下）- 大数跨境

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如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-2（下）

广州市昊洋贸易有限公司

2023-10-31

上文我们介绍了开展qPCR实验所需要提前做的准备工作（共4点，大家可以点击查看），本文继续带领大家学习如何利用qPCR技术开展基因表达分析实验的经验、注意事项。

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2、行动及PCR反应

配置 PCR 反应体系有两个基本原则可确保反应成功：

通过正确使用校准过的移液器或自动化液体处理系统，可最大限度的提高精确度；

通过使用过滤吸头和手套以及将扩增产物远离 PCR 配置区域，可最大限度地减少污染。

RT 和 PCR 重复可用于评估反转录效率和 qPCR 精确度的变化，而无模板对照可用于验证 qPCR 反应中是否存在污染。

在配置 qPCR 反应之前，需要选择如何在反应进行过程中监测 PCR 产物增加的过程。可以选择 SYBR Green I 等插入染料，也可以选择现有的多种探针技术。这两种检测方法都能提供出色的结果，而且各有利弊：探针法可以进行多重定量，而染料法则最具成本效益比，尤其是在定量样品数量有限的情况下。

最后一个需要考虑的重要因素是 PCR 反应的体积。在96孔板或384孔板中，PCR 反应体积可以很容易的分别缩减到 10ul 和 5ul。这不仅能节省试剂成本，还能减少珍贵样品的使用量（因为只有模板的最终浓度会影响 Cq 值）。低于建议的反应体积，很可能会遇到样本蒸发和准确度下降等问题。值得注意的是，由于可加入反应的样品量有限，灵敏度可能会降低。样品预扩增步骤可以解决这个问题。

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3、相信，但要核实

3.1 相对定量

聚合酶链式反应在数学上是一个指数过程，在理想情况下，特异性扩增产物每个周期翻一番。因此，测得的 Cq 值是一个对数值，需要用以下指数函数转换成线性相对量：RQunkn = 2^(Cqcal-Cq unkn) ，其中Cqcal 是校准样品（或参考样品，如未经处理的对照组）的 Cq 值，Cqunkn 是未知样品的 Cq 值，RQunkn 未知样品相对于校准样品的数量，2指数函数的基数，表示100%的 PCR 扩增效率）。Pfaffl 是第一个意识到使用基因特异性 PCR 扩增效率（如果测量准确）可提高结果准确性的学者。

然而，在他的定量模型中，只能在等式中引入一个参考基因进行归一化。如前所述，归一化是数据分析工作流程中的一个关键步骤，在这一步骤中，与样本相关的技术变异被抵消。有研究已经证明，使用多个稳定表达的参考基因可获得更准确的数据和统计学上更有意义的结果，并可对微小的表达差异进行可靠的量化。CFX Maestro 中的定量模型不仅提供了所需的灵活性（在选择一个或多个参考基因方面，无论是否对基因特定的 PCR 扩增效率进行校正），而且还采用了最先进的误差传递规则（为最终定量结果提供置信度）和批间差间校准方案（另见上文）。后者使进行高通量多板实验成为可能，在这种实验中，研究的样本比一个反应板所能容纳的样本要多得多。这一功能不仅能进行大型多中心研究，还能对临床患者进行前瞻性评估。

3.2 生物信息学分析

我们不可能对所有统计检验方法进行综述，以确定两组或多组之间基因表达差异的显著性，确定具有高可置信度的诊断或预后 RNA 标记，找到基因表达模式或样本之间的相关性，或确定相关生物学代谢路径。不过，也可以传达一些重要信息。

首先，对最终的基因表达结果（即归一化的相对量）进行对数变换是一种很好的做法，这样可以使数据分布更加对称（因为基因表达数据通常是对数正态分布）。加上中心极限定理，这样就可以使用依赖于类似正态分布的参数统计检验和计算（如经典的 t 检验、置信区间、方差分析）。

其次，要得出有意义和可靠的结论，需要有独立的生物学重复。最少的重复次数取决于统计检验方法和希望达到的效果（例如，对于置信区间分析，至少需要3 个重复样本；对于非参数配对检验（Wilcoxon 符号秩检验），至少需要 6 个重复样本）。必须明确的是，重复测量（如PCR 复孔）的统计绝对是无稽之谈，因为只测量技术变异。

第三，应在实际实验之前选择统计检验方法，根据需要解决的问题、数据点的数量和数据的分布情况来选择。如有疑问，应咨询（生物）统计学家。

第四，如果数据本身能说明问题，就不要贸然用其它方式分析。这意味着有时差异非常明显，无需进行统计检验。

3.3 报告 qPCR 数据指导原则

生成高质量数据后，下一步就是与同事和合作者交流结果，并在可能的情况下投稿发表。目前的一个主要限制是，Real-time PCR 仪器软件和第三方数据分析软件使用不同的语言，因此生成的数据文件很难甚至无法被没有相同软件的人理解。为解决这一问题，国际 Real-time PCR 数据标记语言（RDML）联盟成立 (http://www.rdml.org) ，其主要目标之一是制定基于 XML 的 Real-Time PCR 数据标记语言（RDML）标准。

RDML 可使 qPCR 仪器与第三方数据分析软件之间、同事与合作者之间、实验者与期刊或公共资料库之间直接交换 qPCR 数据和相关信息。

RDML是《定量荧光 PCR 实验发表所需的最低限度信息》（MIQE）指南和配套核对表的一部分，以确保在报告实验结果时包含关键数据信息。MIQE 以核对表的形式描述了评估 RT-qPCR 实验所需的最低限度信息，该核对表将在首次向出版商提交稿件时随附。

通过提供所有相关的实验条件和检测细节，审稿人可以评估所用方案的有效性。完全公开所有试剂、序列和分析方法对其他研究者复制结果是非常必要的。遵循这些指导原则将有助于改进实验实践，从而对定量 PCR 结果做出更可靠、更明确的解释。

结论

RT-PCR 是一种快速、准确、灵敏且经济有效的基因表达分析方法。然而，该技术本身的简单性使其在实验中容易被滥用，如果操作者在整个过程中没有执行必要的质量控制。综上，我们概述了工作流程中的不同步骤，并逐点指出了关键问题的解决地点和方法。按照本文的建议，任何用户都能使用 RT-qPCR 技术成功地完成基因表达分析。

未完待续

敬请关注“如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来”系列文章，教会您如何在 MIQE 的指导下开展 qPCR（RT-PCR）实验，获得可靠的实验结果。

参

考

资

料

1、[1] Derveaux S , Vandesompele J , Hellemans J .How to do successful gene expression analysis using real-time PCR, ScienceDirect [J].Methods, 2010, 50(4):227-230.

DOI:10.1016/j.ymeth.2009.11.001.

https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.11.001

* BIO-RAD是BIO-RAD LABORATORIES, INC. 在特定区域的商标。

* 本产品仅用于科研用途，不用于临床诊断。

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