如何让你的 SCI 文章 MIQE 起来-3(下）

geNorm 算法

geNorm 是一种流行的算法，用于从给定的样本中，从一组内参基因 panel 中选择最稳定的内参基因。由此，可根据用户定义的内参基因数量的几何平均数值计算出每个样本中基因表达归一化因子。该算法还能确定准确归一化所需的最佳内参基因数量。

从2002年到2010年，Microsoft Excel geNorm 2002 年版本在全球的下载次数已超过15,000次。自2010年起，用于定量 PCR 数据分析的 qbase+ 软件在 Windows、Mac 和 Linux 中集成了改进的 geNorm 模块。

目前已有20多年历史的 Microsoft Excel 版 geNorm 由于多种原因已不再可用（不再与最新版本的 Excel 兼容、速度慢、难以使用）。

之后 geNorm 成为了 Biogazelle 公司用于qPCR 数据分析的 qbase+ 软件的一部分，直至2021年底 Biogazelle 被 CellCarta 收购。2022年底，CellCarta 宣布停止 qbase+ 后续的技术支持、升级和维护，目前可以免费使用。

据谷歌学术（Google Scholar）的统计，超过2万篇论文引用了 geNorm 方法。发表这个算法的文章是《Genome Biology》杂志过去二十年中上“访问量最大、最有意义的文章”之一。

每个内参基因与所有其他内参基因的平均成对变异来确定内参基因的稳定性度量（M），并能剔除最不稳定的基因，重新计算 M 值，从而对最稳定的基因进行排序。M 值越低，基因的稳定性越高，即最稳定基因的特征是 M 值最低；良好的内参基因在同质和异质样本中的 M 值应分别低于0.5或1。此外，通过计算两个连续归一化因子 NFn 和 NFn+1 之间的成对变异 Vn/Vn+1（n 个内参基因表达水平的几何平均数），可以确定计算可靠的归一化因子所需的最小基因数。逐步加入内参基因，直到 Vn/Vn+1 降到0.15的推荐阈值以下，此时使用额外基因（n+1）的益处有限，因此可以确定内参基因的个数。

可使用 qbase+ 软件 (最新版本3.4)进行基因稳定性分析。（小编亲测使用较为繁琐，需要多次操作，需要结合使用说明书）

BestKeeper 

BestKeeper 是一个基于 Microsoft Excel 的成对相关性分析工具，也是一款免费工具，用于确定对数据进行归一化处理的最佳内参基因。它可筛选最多十个候选基因，并将它们组合成一个指数。该指数可与其他十个候选基因进行比较，以确定它们在应用处理中是否有差异表达。

RefFinder  

是一款基于网络的用户友好型综合工具，用于从大量实验数据集中评估和筛选内参基因。它整合了当前可用的主要计算工具（geNorm、Normfinder、BestKeeper 和比较 Δ-Ct 方法），对测试的候选内参基因进行比较和排序，相当于上述软件/工具的集成。根据每个程序的排名，它为每个基因分配了适当的权重，并计算出它们的权重的几何平均数，从而得出最终的总排名。注：四川省农业特色植物研究所的 LIZhen建立并维护了 RefFinder 镜像站点

CFX Maestro 软件

由 Bio-Rad 公司开发，基于 geNorm 算法来筛选合适的内参基因，最大的优势是结果展示非常直观，如上图，绿色部分就是理想的内参基因，红色为表达量不稳定，需要排除。同时该软件可以完成布板、PCR 运行、统计学分析、数据导出、生成高分辨图表等等，是一站式的 qPCR 数据分析软件。

1、研究背景： 

感染流感病毒的肾阳虚综合征（KYDS）是模仿流感感染高危人群的一个理想模型，其发病率和死亡率都很高，但这种疾病的具体分子机制仍不清楚。要利用 RT-qPCR 准确估计 KYDS 小鼠细胞中基因对甲型 H1N1 亚型流感病毒（A/H1N1）感染的相对表达量，必须确定合适的内参基因。

2、候选内参基因 pool 

评估10个来自于文献的候选基因，涉及的代谢通路或功能类型包括：糖酵解、神经前体细胞表达、微管蛋白、加氧酶活化、真核翻译起始因子等等。

3.候选内参基因筛选的验证 

KYDS 模型小鼠分为接种 A/H1N1 病毒或设置模拟对照组，分别20只。

实验组模型小鼠的处理过程

4种常用统计程序 geNorm、BestKeeper 、NormFinder 以及 Bio-Rad Maestro™ 软件来评估内参基因的稳定性。另外使用 CFX Maestro 自动计算功能，用于阈值设置和基线校正，还利用单阈值线模式的平均值确定 Cq 值。

使用 2^-ΔΔCq 公式将 Cq 值转化为非归一化相对表达量，其中：ΔCq= 对应 Cq 值-最小 Cq 值。这些转换后的表达量用于 geNorm 和 NormFinder 计算。

从下表可以明显的看出，在4种样本类型中，4种评估工具筛选出来的稳定内参基因大体相同（如前3位，因为计算相对基因表达量时，内参基因的个数推荐≥3个，或者至少2个）。

根据几何平均值，对每个组织中基因进行排序，候选基因的理想程度从高到低排列。从下图可以看到，CFX Maestro 软件得出的排序与上图的结果基本一致。

为验证所选内参基因的一致性，对 KYDS 病毒样本中这些基因的表达量进行了测定。

选择在宿主先天免疫反应中发挥重要作用的 TLR3、TLR7 和细胞膜 RIG-I 的表达水平，它们都属于宿主模式识别受体，在病毒感染过程中识别病原体相关分子模式，识别病原体相关分子模式会增强干扰素调节的转录因子，刺激 NF-κB，进而导致细胞因子和趋化因子等炎症介质的分泌。因此，对4种组织中 TLR3、TLR7 和 RIG-I 的表达水平进行了量化。

以肺部和心脏的 Nedd8 表达水平、肝脏的 Rnf187 表达水平和肾脏的 Tubα 表达水平作为内参基因（这些内参基因表达最稳定），感染后肺部的 TLR3 和 TLR7 表达显著增加（P<0.01，下图 A），肝脏的 TLR7 表达增加（下图 C） ，心脏和肾脏的 RIG-I 和 TLR7 表达增加（P<0.01）（下图 B 和 D ）。

另外，被认为最不稳定的内参基因是 肺样本中的 GAPDH；心脏和肾脏中的 β2m；以及肝脏中的 α（Tubα）（下图 ）。使用这些内参基因，肺组织中 TLR3 的表达未观察到明显变化（下图 A），心脏组织样本中 RIG-I 和 TLR7 的表达有所下降（P<0.05 或 P<0.01；下图  B），肾组织中 RIG-I 的表达方向出现逆转（下图 D；P<0.01）。

正常小鼠和模型小鼠 (A) 肺、(B) 心、(C) 肝和 (D) 肾组织中 TLR3、TLR7 和 RIG-I 的相对 mRNA 表达水平（*P<0.05 ，**P<0.01）