PASEF 交响曲 —— timShift 开启 ABPP 分析新思路

图1. ABPP实验示意图和ABP结构示意图

1. 前处理过程中探针标记蛋白的富集步骤需要多次洗涤、缓冲液交换和洗脱步骤，将探针修饰肽段与未修饰肽段进行分离，易导致样本损耗，尤其会造成低丰度活性蛋白信息的丢失。为弥补样本损失，ABPP 传统流程对样本起始量要求较高，难以适配微量、稀有生物样本的分析场景; 
2. 检测通量与灵敏度不足，既难以捕捉低丰度活性蛋白及蛋白微小活性变化，也无法在保证灵敏度和鉴定深度的前提下，实现大规模样本的高通量分析。

ABPP 设计新思路：基于 timsTOF 特色自定义 PASEF 采集设计，实现探针标记肽段分离的创新突破。

timsTOF 仪器核心捕集离子淌度（Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS）和平行累积-连续碎裂（PASEF）技术，为蛋白组学多种应用场景赋能提供了核心支撑 —— 它不仅能测定离子的碰撞截面积（CCS），进一步提升仪器灵敏度，实现四个维度（RT、m/z、Intensity and CCS）的定性定量分析。更关键的是，其独特TIMS技术可提供基于 m/z 和淌度维度为母离子选择框定个性化的多边形范围，精准聚焦不同应用下特征母离子分布范围进行精准选择和碎裂，避免非目标离子占用检测资源。近年来，timsTOF针对不同应用场景持续迭代更新，演化出glyco-PASEF、thunder-PASEF 等多种专属采集方法。

近期发表于《Analytical Chemistry》的 timShift 探针技术^[2]，为 timsTOF 赋能 ABPP 提供了全新思路 —— 通过探针修饰改变肽段离子迁移率，直接借助淌度气相维度实现探针修饰肽段与未修饰肽段的分离，彻底革新了化学蛋白组学的分析流程。文章中 “修饰诱导理化性质改变 — 气相维度精准分离 — 设置母离子范围选择和碎裂” 的完整需求，与 timsTOF 仪器的技术特性完整契合，堪称设计逻辑与仪器功能的精准匹配，进一步简化分析流程，提升鉴定深度，为更微量和大规模研究提供新的可能（图2.A）。

图2. (A) 气相分离 vs. 溶液分离分析流程 

(B) timShift 探针设计原理及应用

timShift 探针的核心设计逻辑是利用修饰诱导肽段物理性质改变，并在气相维度进行分离。探针与活性半胱氨酸共价结合后，不会显著改变肽段的质荷比，却能大幅提升其离子迁移率，基于 timsTOF 的高分辨淌度池 TIMS，根据探针修饰肽段和未修饰肽段的淌度差异，直接在质谱淌度气相维度进行分离，无需任何传统的溶液富集步骤，可直接通过 timsTOF 质谱实现探针修饰肽段的选择性检测。

经 timShift 探针修饰后，近 98% 的离子会出现显著的迁移率偏移（图3.A），与未修饰肽段离子形成清晰的分离边界，通过 timsTOF 质谱的 m/z-CCS 二维过滤，可自定义前体离子选择范围（图3.B），在气相维度直接靶向探针修饰肽段的检测。timShift 技术通过设计优化的母离子多边形窗口，实现鉴定数量约 2.5 倍提升，由 1109 个增加至 2750 个（P<10⁻⁴），且检测到的未修饰肽段占比进一步降低（图 3.C）。

图3. (A) 修饰肽段离子vs.未修饰肽段离子分布

(B) 修饰肽段离子母离子选择范围优化

(C) 标准条件和优化条件下检测到的总肽段和标记肽段数量

与传统亲和富集方法相比，本方法仅需 1/25 的样本起始量—以 20 μg 蛋白质上样，即可达到与之前500 μg相当的鉴定深度，大幅规避了传统方法因洗杂、洗脱等步骤导致的样本损失。同时，将 timShift 探针用于共价抑制剂 sulfopin 的活性蛋白组分析研究（图 4.B），在 DDA 模式（200 万个细胞）和 DIA 模式（2 万个细胞，相当于蛋白质起始量不到 2 μg）中均精准检测到该抑制剂与 Pin1 蛋白特异性位点 Pin1-C113 的结合，还能呈现剂量依赖性反应识别已知靶点和潜在新脱靶位点，充分验证了其在低样本量场景下的高可靠性。文章进一步将探针用于针对 31 种含不同活性基和杂环骨架的亲电片段分子，采用 96 孔板配置进行高通量处理，使用该方法鉴定到了超过 8200 种半胱氨酸反应位点，相较于传统ABPP富集方法，气相分离的优势堪称颠覆性。

图4. (A) timShift探针vs.传统DTB方法的活性半胱氨酸鉴定数目和起始量对比

 (B)Pin1共价抑制剂Sulfopin的活性分析

• 免富集流程：极大简化前处理，减少样本损失

• 分离原理创新：巧妙设计探针带来修饰肽淌度位移，在 timsTOF 平台淌度管内分离与选择

• 超高灵敏度：仅需 20 μg 起始蛋白，效果等同传统流程 500 μg ，灵敏度提升 25 倍

• 高通量适配：可集成所有处理步骤于 96 孔板，满足大规模研究需求

基于 timsTOF 的 ABPP 研究不断挖掘出该平台在提升深度、分析通量及降低样本起始量方面的核心潜力。timShift探针技术的出现，标志着 timsTOF 在 ABPP 中的应用从“维度增加”迈向“原理创新”，打破了传统富集思路，将复杂的前处理流程转移至质谱仪内部，充分发挥了 timsTOF 仪器的 TIMS 气相分离和富集的优势。这一研究不仅为半胱氨酸活性分析提供了新方案，更为其它 ABPP 研究提供了可借鉴的范式—通过设计能够针对性影响离子迁移率的分子活性探针，利用质谱的淌度气相维度分离提升检测的特异性与灵敏度并简化前处理流程。未来，随着探针设计的多元化与仪器性能的持续优化，timsTOF 有望在药物研发、疾病研究等领域发挥更大作用，推动化学蛋白组学向更微量、更高效、更精准的方向迈进，为生命科学研究与临床转化注入强大动力。

参考文献

[1] Chu W, et al. Activity-based protein profiling. Acta Chim. Sinica. 2015, 73, 657-668.doi: 10.6023/A15040223

[2] Peter B, et al. Gas Phase Separation of Modified Peptides for Activity-Based Protein Profiling. Anal. Chem. 2025, 97(30), 16652-16662. doi: 10.1021/acs.analchem.5c03300