质谱技术的飞跃，正将生命科学研究推向单细胞层面的精准探索。本研究突破性地利用 timsTOF Ultra与 4D-代谢组学工作流程，直击药用植物长春花（Catharanthus roseus）单个细胞内的生物碱化合物，不仅实现了单细胞代谢物的精准检测，更揭示了 4D 技术在未知化合物鉴定中的强大潜力。在单细胞的微观尺度下，高分辨率质量精度、PASEF技术分析能力与捕集离子淌度技术（TIMS）强强联手 —— 前者精准 “称重” 分子，中者深度 “拆解” 结构，后者巧妙区分 “同分异构体” ，三者协同作用显著提升研究效能。
实验方法
1、
单细胞分选
1) 根据参考文献方法从长春花叶片中提取原生质体（去除细胞壁的细胞）[1,2]，利用CellCelector™ Flex（Sartorius）细胞挑取装置，对单个细胞成像、筛选后，转移至含 5μL 0.1%甲酸水溶液的 96 孔板中。
2) 加入 7μL 含 20nM 阿义马林（内标，IS）的甲醇裂解细胞；取 2μL 各细胞提取物混合，制备混合样本。96 孔板以 1000×g 离心 2 min 后，分别取 4μL 细胞提取物及混合样本注入系统进行反相色谱分析。
实验方法
2、
LC-MS/MS 检测
1) 采用 Agilent 1290 Infinity II 与 timsTOF Ultra 联用系统，搭配 VIP-HESI离子源与PASEF技术，在正离子模式下进行数据采集，液相梯度时长为 7 min（表 1）。
2) 混合样本通过 4D PASEF 模式获取高可信度 MS/MS 数据，助力未知物鉴定。淌度范围 (1/k0) 设置： 0.45-1.45V·s/cm2，Ramp time: 100 ms。针对单细胞提取物，在 120-1000 m/z 质量范围内采集 3D 数据。
数据分析
使用 TASQ® 2024b 定量细胞中 9 种关键生物碱化合物（表2）并计算其峰强度；使用 MetaboScape® 2024b 软件进行非靶向代谢组学分析，评估混合样本中可检测到的 Feature 总数及具有对应二级质谱（MS2）数据的Feature总数。
表 2. 单细胞分析中的目标化合物
结果分析
1、
细胞亚型精准分型
本研究对 168 个单细胞的分析显示，9 种关键生物碱可明确区分三类细胞亚型：
异细胞（idioblast cell）：文多灵（Vindoline）作为异细胞（IB）亚型的特征性物质，在 5 个细胞中被检出[1]；
表皮细胞（Epidermal Cell）：在 31 个单细胞中检测到开联番木鳖苷（Secologanin）[1]，为生物碱合成提供早期前体；
IPAP 细胞：马钱苷酸（Loganic acid）在 2 个细胞中检出，提示为长春花叶内与韧皮部相关的薄壁细胞。
图1. 长春花中异细胞、表皮细胞和IPAP细胞分离样本图像( E1、D5 和 D2 代表多孔板上的孔位)
图2. 长春花异细胞提取物中 6 种生物碱及内标Ajmaline的提取离子流图（EICs）
结果分析
2、
代谢物的高可信度注释
混合样本经 4D - 代谢组学方法（PASEF）分析，借助 TIMS 离子淌度排序结合同步CCS测量，实现了高频率的前体离子选择与碎裂；在此基础上，利用 MetaboScape® 中的光谱数据库（SL）和自定义目标列表（TL，含有关键生物碱的保留时间及 InChI 结构数据列表），最终可靠注释出 133 种代谢物，为单细胞代谢网络解析提供了坚实基础。以长春质碱为例，对比参考谱图（NIST 2020 MS/MS 光谱库）与实测谱图（基于 PASEF采集的MS/MS谱图），MS/MS 得分为 970（满分1000 分），表明注释结果可靠（图3）。
即便在缺乏参考 MS/MS 光谱数据的情况下，通过对目标列表中已知结构进行计算机模拟碎裂（In-silico fragmentation），也能借助预测的碎片数据实现高可信度注释。图4 展示了代谢物的结构、预测的 MS/MS 谱图及碎片结构。长春质碱的实测CCS 值与预测 CCS 值的偏差为 0.5%，匹配度优异；计算机模拟MS/MS碎裂的匹配得分达 948 分。综上，利用机器学习算法CCS-Predict Pro（CCS预测技术）、计算机模拟MS/MS碎裂技术，结合碎片结构可视化检查，共同提升了该特征注释为长春质碱的可信度。
结果分析
3、
4D 技术突破同分异构体鉴定难题
图 6. 离子淌度有效分离代谢物（C₂₁H₁₄N₂O₃）在LC上共洗脱同分异构体
结论
timsTOF Ultra 赋能单细胞代谢研究
timsTOF Ultra 平台实现植物单细胞生物碱的可靠检测，结合 4D-代谢组学工作流程可精准分类细胞亚型并提升注释可信度，成功注释出 133 种代谢物。
捕集离子淌度技术 (TIMS) 有效区分共洗脱同分异构体，显著提升化合物鉴定的准确性；
MetaboScape软件：整合计算机模拟MS/MS谱图碎裂（In-silico fragmentation）和 CCS 预测功能（CCS-Predict Pro），为未知化合物鉴定提供强大支撑。
参考文献
[1] Li C, Wood JC, Vu AH, Hamilton JP, Rodriguez Lopez CE, Payne RME, Serna Guerrero DA, Gase K, Yamamoto K, Vaillancourt B, Caputi L, O’Çonnor SE, Buell CR (2023). Single-cell multi-omics in the medicinal plant Catharanthus roseus. Nat. Chem. Biol. 19, 1031-1041.
[2] Vu AH, Kang M, Wurlitzer J, Heinicke S, Li C, Wood JC, Grabe V, Buell CR, Caputi L, O’Connor SE (2024). Quantitative single-cell mass spectrometry provides a highly resolved analysis of natural product biosynthesis partitioning in plants. J. Am. Chem. Soc. 146, 23891–23900.
