γ-PGA可作为小麦抗旱剂，促进小麦生长

γ-PGA是一种生物聚合物，具有生物相容性、可生物降解、无毒等特点，在伤口愈合、生发促进剂、抗衰老血清、抗肿瘤、止苦剂、支架、重金属去除、骨软骨再生、食物增稠剂等方面具有潜在应用，可以成为合成高吸水性剂的有吸引力的替代品。由于糖晶体在制糖工业中被精炼，糖蜜是留下的副产品，可以对其进行增值以生产2,3-丁二醇、低聚糖、左榄糖、葡聚糖等，马赫什· 达恩等研究了糖业副产品（如糖蜜）生产γ-PGA及其在减排中的应用抗旱胁迫，提高作物产量。

实验设计

使用最少量的发酵培养基组分获得γ-PGA的最大产量。为了在进行培养基优化后检查糖蜜对γ-PGA生产的影响，在对照组E中，使用蔗糖作为糖蜜的替代品。下表 1 描述了在柠檬酸、硝酸铵和各种微量元素存在下使用糖蜜生产γ-PGA 的培养基优化。最终优化的培养基由30%的糖蜜和2%的硝酸铵组成。γ-PGA的初步表征通过薄层色谱（TLC）进行。使用配备金刚石晶体探针探测器的布鲁克 Tensor II 分光光度计对 γ-PGA 进行了表征。使用YMC填充的二醇-200色谱柱通过HPLC测定γ-PGA的分子量；纯度γ-PGA由HPLC使用Diol-200色谱柱测定。

“最小养分，最大产量”概念的实验设计

评估了副地衣芽孢杆菌 NCIM 5769 利用营养成分最少的糖蜜进行 γ-PGA 生产的能力（图 1a）。结果表明，确定糖蜜的最佳浓度为30%。探索了改性培养基E（E1、E2、E3）中的γ-PGA生产，以研究糖蜜是否被用作碳源的替代品或用作多营养废物培养基。改良的 E培养基中没有γ-PGA合成表明B. paralicheniformis NCIM 5769 利用糖蜜作为多营养废物，而不仅仅是碳源。对30%糖蜜的HPLC分析进一步证实了这一假设，该分析显示分别存在32%的谷氨酸，22.8%的蔗糖，2.2%的葡萄糖和1.43%的果糖（图1c;这证明B3培养基中的产生可能是由于糖蜜中过量的谷氨酸。因此，最佳培养基由30%糖蜜和硝酸铵组成，符合“最小养分最大产量”的概念。

图 1.a. “最小养分，最大产量”概念的实验设计 b.硝酸铵对L-谷氨酸从糖蜜中独立产生γ-PGA的影响 c.使用HPLC对30%糖蜜进行营养分析

硝酸铵对糖蜜中L-谷氨酸独立产γ-PGA的影响

副苔藓芽孢杆菌进一步评估了 NCIM 5769 在硝酸铵含量增加的改性B培养基中产生 γ-PGA 的能力（图1b）。当硝酸铵浓度为1%时，γ-PGA产量在48小时内从26 g/L（10%糖蜜）增加到112 g/L（30%糖蜜）。然而，在2%硝酸铵下，γ-PGA产量在48小时内从31 g / L（10%糖蜜）提高到132 g / L（30%糖蜜）。因此，最终优化的培养基由30%的糖蜜和2%的硝酸铵组成。γ-PGA发酵液的粘度如图S3所示。目前，这是使用L-谷氨酸独立喂养方法从糖蜜分批发酵中获得的最高量γ-PGA（见表2）。

γ-PGA的表征

在TLC中，水解样品中仅存在L-谷氨酸单体表明从糖蜜中产生γ-PGA（图2a）。根据FTIR分析，合成的γ-PGA在3402 cm处表现出强烈的N-H拉伸， N-H 弯曲处1595厘米， C-H 弯曲处 1403 cm，C=O在1082 cm处拉伸，其与标准γ-PGA的色谱图相似（图2b;图2c）。与标准γ-PGA（RT 6.313 min）相比，合成的γ-PGA的HPLC色谱图在RT 6.400 min处显示出尖锐的峰值。此外，在合成的γ-PGA的色谱图中未观察到额外的峰，表明其纯度与标准γ-PGA相似（图2d；图2e）。合成和标准γ-PGA的分子量均为790千道尔顿（图2f；表S1）。

图 2.由糖蜜生产的γ-PGA的TLC

不同浓度γ-PGA缓解干旱胁迫对小麦植株的影响

对小麦植株进行了本土合成γ-PGA的抗旱活性评价。当检查0.1%、0.5%、1.0%、2.0%和3.0%的γ-PGA浓度对抗干旱胁迫的潜力时，与对照组相比，添加2%γ-PGA溶液可显著提高枝条长度（31 cm）、生物量含量（60 mg）和发芽率（93%）。对照组的发芽率（60%）、生物量含量（33.4 mg）和枝条长度（13.3 cm）均显著降低（图3）。然而，与对照组（16.33 cm）相比，根长（17 cm）没有显着增加。最可能的原因是细胞分裂素和生长素相互拮抗，控制干旱胁迫下的芽根比。结果表明，γ-PGA的施用增加了ABA和其他细胞因子的水平，但对生长素的影响很小，导致枝条长度增加，但根长没有明显增加。

图 3.γ-PGA缓解干旱胁迫对小麦的影响.

利用γ-PGA缓解干旱胁迫的小麦植株

γ-PGA发酵肉汤采用以下γ-PGA：水比（1：10、1：15、1：20、1：25）的水稀释。纳入了三种不同的对照组，包括培养基对照（30%糖蜜和硝酸铵）、培养对照（副地衣芽孢杆菌）和水，以排除培养基成分和培养对干旱胁迫的任何潜在影响。与对照组相比，添加（1：20）γ-PGA溶液的枝条长度（24.8 cm）、生物量含量（77.5 mg）和发芽率（97%）显著增加，这些稀释液测试了各种γ-PGA稀释度的抗旱功效。培养基对照、培养对照和水分的发芽率（3%、73%、70%）、枝条长度（1.3 cm、13.6 cm、10.93 cm）和生物量含量（1.5 mg、27.86 mg、25 mg）均较低。

图 4.γ-PGA发酵肉汤对减轻干旱胁迫对小麦的影响

γ-PGA缓解小麦植株干旱胁迫的田间试验

与温室中的条件相比，种子会经历极热、极冷和更多的水分流失。因此，在30天的现场评估了γ-PGA发酵肉汤（PGA：水比1：20）的效果（图5）。与对照组相比，对照组直到第七天才看到发芽，治疗组在4天内显示出发芽。在第七天，在对照组中只观察到轻微的发芽。处理组和对照组的枝条长度分别为：第4天（2.8 cm，0 cm）、第7天（9.5 cm，2 cm）、第10天（17.63 cm，5 cm）、第15天（27.7 cm，8.3 cm）、第20天（33 cm，10.4 cm）。根长没有明显增加。30天后，处理组的生物量含量（95 mg）、枝条长度（36 cm）和发芽率（80%）明显增加。然而，对照组的发芽率 （15%）、枝条长度 （11 cm） 和生物量含量 （31 mg） 显着降低。叶片枯萎和黄变是对照组干旱胁迫的明显迹象。

图 5.干旱胁迫对小麦植株影响的田间研究

1. γ-PGA在小麦植株上展现出显著的抗旱活性，包括更快的发芽速度、增加的枝条长度和生物量含量，以及更高的发芽率。

2.副地衣芽孢杆菌NCIM 5769能够在48小时内将糖蜜高效转化为γ-PGA。

3. 通过“最小养分，最大产量”的概念，确定了30%糖蜜和2%硝酸铵的培养基组合，为γ-PGA生产提供了最佳条件。

4.实现了132 g/L的γ-PGA收率和2.75 g/L/h的生产率，这是目前使用L-谷氨酸独立喂养策略从糖蜜中产生γ-PGA的最高产量。