近期为研究如何通过开发新方法提高γ-PGA产量，张超，吴道吉，邱学良等学者研究了不同氨基酸对枯草芽孢杆菌Z15产生γ-PGA的影响。3 g/L天冬氨酸、1.5 g/L苯丙氨酸和7 g/L谷氨酸分别提高了γ-PGA收率23.18%、12.15%和31.46%。此外，等电结晶后谷氨酸的粗提物（CEGA）可以替代谷氨酸，用于γ-PGA生产。采用响应面法（RSM）进行进一步优化。最终得到氨基酸培养基成分如下：CEGA 9 g/L，天冬氨酸4 g/L，苯丙氨酸1.55 g/L。通过在5-L生物反应器中应用该收据，44小时后γ-PGA收率达到42.92±0.23 g/L，比不含氨基酸的对照组高63.1%。此外，氨基酸可以缩短滞后期和平均发酵时间，添加氨基酸发酵是γ-PGA生产的积极选择。
γ-聚谷氨酸是什么？
γ-聚谷氨酸是一种天然聚合物，由D-和L-谷氨酸单元组成，通过γ-酰胺键连接，这种不寻常的阴离子聚合物具有水溶性、吸水性、金属结合性、可生物降解、可食用且对人体和环境无毒，γ-PGA生产成本高是其商业化的主要障碍，这主要与γ-PGA的低产率有关。针对γ-PGA应用的增加，有必要通过开发新的策略来提高γ-PGA的产量。
氨基酸是什么？
氨基酸是一种重要的生长限制因子，可以促进微生物的生长和代谢产物的合成。已广泛应用于生化药物、酶制剂、抗生素等多种生化产品的生产过程中。合适的氨基酸添加策略为两步：首先，在培养2 h后加入2 mM半胱氨酸，然后在培养7 h后加入3种氨基酸（丝氨酸、甘氨酸和谷氨酸）。采用这些氨基酸添加策略，谷胱甘肽收率达到1.875 g/L，约为不添加氨基酸的2.67倍。产生PGA的细菌分为两种类型：L-谷氨酸依赖性细菌和L-谷氨酸依赖性细菌。目前，大多数关于γ-PGA生产的研究都集中在枯草芽孢杆菌的L-谷氨酸依赖性菌株上。因为产量高,因此，我们在本研究中选择了枯草芽孢杆菌Z15进行γ-PGA生产。
试验设计
收集谷氨酸发酵液（谷氨酸，8.04±0.15 g/L）、等电结晶后的谷氨酸粗提物（谷氨酸质量分数，80.09±0.24%）和结晶后的谷氨酸粗品（谷氨酸质量分数，90.16±0.19%），在4°C下贮存。将来自斜面的细菌环转移到含有30ml种子培养基的250ml烧瓶中。将种子培养物在旋转振荡器上在37°C下运行孵育24小时。枯草芽孢杆菌Z15 在含有 50 ml 发酵培养基的 250 ml 烧瓶中进行，接种了 10% （v/v） 的种子培养物。培养条件为200 r/min、37 °C、48 h。三个因素是天冬氨酸（A）、苯丙氨酸（B）和谷氨酸（C）。评估的响应 Y 是 γ-PGA 产量 （g/L）。在三个不同的水平上研究了这三个因素（表3），并进行了20组实验（表4）。在5-L生物反应器中进行批量培养。生物反应器的液体填充量为60%（v/v）。肉汤的pH值、搅拌量和温度分别保持在7.0、200 r/min和37 °C，发酵过程持续60 h。每4 h采集一次样品进行生物质积累和γ-PGA生产分析。
单氨基酸添加对γ-PGA生产的影响
各种氨基酸对γ-PGA生产的影响见表1。根据γ-PGA增加率，氨基酸分为以下四类：
（1）天冬氨酸和苯丙氨酸可显著提高γ-PGA的产量（10%）;
（3）丝氨酸、精氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸和缬氨酸的添加对γ-PGA合成无明显影响;
（4）谷氨酰胺和赖氨酸的添加降低了γ-PGA的产量和生物量。
此外，随着天冬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸的增加，γ-PGA收率分别提高了5.96%、2.28%和6.46%。当精氨酸和缬氨酸用量增加时，γ-PGA产量无明显变化。因此，选择天冬氨酸、苯丙氨酸和谷氨酸进行进一步研究。
γ-PGA的代谢途径尚未完全阐明，可能的代谢途径如图1所示。其他氨基酸的合成伴随着γ-PGA的合成。在γ-PGA的代谢过程中，L-谷氨酸由α-酮戊二酸通过三个羧酸（TCA）循环生成。部分L-谷氨酸转化为D-谷氨酸。γ-PGA由L-谷氨酸、D-谷氨酸和外源前体合成。苯丙氨酸的加入使代谢通量转化为丙酮酸。因此，更多的丙酮酸进入TCA循环，不抑制丙酮酸的合成。天冬氨酸在TCA中产生更多的草酰乙酸循环。同时，天冬氨酸在γ-PGA的合成途径中需要大量的ATP，而ATP的合成需要天冬氨酸的参与。2.0 g/L的天冬氨酸不会完全阻断草酰乙酸、天冬氨酸的合成，并保证TCA循环中草酰乙酸的量较多。总之，天冬氨酸的加入不仅影响了草酰乙酸合成L-天冬氨酸的阻断，而且保证了草酰乙酸更多地参与TCA循环。
谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸添加时间对γ-PGA生产的影响
根据表1，研究了添加时间对γ-PGA合成的影响（图1），在枯草芽孢杆菌 Z15 肉汤中，0-10 小时为滞后期，10-48 小时为指数期，48-56 小时为固定期。因此氨基酸的添加时间设定如下：0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和 36 h。氨基酸浓度为1 g/L。如图所示。天冬氨酸和苯丙氨酸的加入时间为0 h，指数期（24 h）加入谷氨酸可促进γ-PGA的合成。
在γ-PGA合成过程中，在γ-PGA合成的早期阶段不需要大量的谷氨酸，如图1所示。早期添加谷氨酸可能会抑制谷氨酸的合成，或以谷氨酸作为氮源。因此，指数期中谷氨酸的加入有利于γ-PGA的合成。结果如图1所示。
氨基酸浓度对γ-PGA生产的影响
结果如图所示。酸过多或过少均不影响γ-PGA的积累。谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸的最佳浓度分别为7 g/L、3 g/L和1.5 g/L。
不同来源谷氨酸对γ-PGA生产的影响
通过实验对谷氨酸发酵液（GCFB）、等电结晶后谷氨酸粗提物（CEGA）和结晶后谷氨酸粗品（CMG）进行评价。这些量的前体取代由对照组（L-谷氨酸，60 g/L）平均转化。
如表2所示，CEGA、CMG和对照组对γ-PGA的产生具有相同的有益影响，这表明CEGA和CMG是谷氨酸的理想替代品。然而，与CEGA相比，CMG的价格要贵几倍。因此，在接下来的实验中选择CEGA作为γ-PGA生产的谷氨酸的替代品。GCFB对γ-PGA的产生有负面影响，可能受到发酵液中某些抑制剂的影响。
Box-Behnken 设计和响应面分析
采用Box-Behnken设计（BBD）测定3种氨基酸（天冬氨酸、苯丙氨酸和CEGA）的最佳水平。表 3 显示了 Box-Behnken 设计中使用的因子水平，结果如表 4 所示。分析二次设计的方差以检查模型的有效性（表5）。
该结果清楚地表明，实验值呈线性分布，相关性较高（R2= 0.9864）。因此，该模型足以预测所研究变量范围内的γ-PGA值。在4 g/L天冬氨酸、1.55 g/L苯丙氨酸和9 g/L CEGA条件下，γ-PGA最大收率为42.66 g/L。为了验证这一预测，进行了3次独立发酵，γ-PGA收率为42.92±0.27%。
采用RSM分析了3个变量（天冬氨酸、苯丙氨酸和CEGA）对γ-PGA生成的影响。研究了三维响应面图和等值线图，以研究任意两个变量对响应的交互作用（图1）。4）.
图4 相互影响的表面图和等值线图。（1）天冬氨酸（A）和苯丙氨酸（B）的作用;（2）天冬胰岛素（A）和CEGA（C）的作用;（3）苯丙氨酸（B）和CEGA（C）的作用。
在5-L生物反应器中批量培养
（图5b）显示了添加氨基酸的枯草芽孢杆菌Z15的发酵曲线。（图5a）介绍了未添加氨基酸的枯草芽孢杆菌Z15的发酵过程。如图所示。在肉汤中额外添加氨基酸后，在4 h内观察到枯草芽孢杆菌Z15在肉汤中的生长，这在未添加氨基酸的情况下在枯草芽孢杆菌Z15的肉汤中显示为8 h。这表明氨基酸的存在可以缩短滞后期。培养4小时后，细胞开始生长，当还原糖的浓度开始降低时。同时，γ-PGA分泌到肉汤中，γ-PGA的浓度在指数期迅速增加，在固定期达到平台期。γ-PGA的生产伴随着还原糖的消费。在还原糖耗尽后，没有进一步的γ-PGA产生。44 h后，最终细胞浓度为18.67±0.20 g/L，γ-PGA产量为42.92±0.23 g/L。
1、枯草芽孢杆菌Z15在发酵过程中，添加氨基酸可以显著提高γ-PGA的产量，并且缩短发酵时间。
2、通过添加特定浓度的氨基酸（3 g/L天冬氨酸、1.5 g/L苯丙氨酸和7 g/L谷氨酸），γ-PGA的收率分别提高了23.18%、12.15%和31.46%。
3、使用较少的天冬氨酸和苯丙氨酸，并用CEGA（等电结晶后谷氨酸粗提物）替代大量谷氨酸，可以显著降低培养基的成本。
4、将优化后的氨基酸添加策略应用于5-L生物反应器的分批发酵，44小时后γ-PGA的产量达到42.92±0.23 g/L，比对照组提高了63.1%，并且缩短了滞后期和发酵时间。
Zhang， C.， Wu， D. & Qiu， X. 氨基酸对枯草芽孢杆菌产生γ-聚谷氨酸的刺激作用。科学代表 8， 17934 （2018）
文案 | 数据来源Zhang， C.， Wu， D. & Qiu， X. 氨基酸对枯草芽孢杆菌产生γ-聚谷氨酸的刺激作用。科学代表 8， 17934 （2018）
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