在生物催化的赛道上，科研人员常面临这样的困境：海量酶变体库中藏着理想的催化 "明星"，但传统筛选方法要么耗时数天，要么难以区分结构相似的同分异构体，导致错失关键活性变体。
近期，加州大学圣克鲁兹分校的科研团队借助布鲁克 timsTOF MALDI PharmaPulse®（timsTOF MPP）高通量筛选方案，成功破解了这些难题。他们针对红藻氨酸合成酶的 1054 个基因多样化变体进行筛选，不仅精准区分了红藻氨酸合成酶（KS）催化前红藻氨酸（PKA）产生的两种同分异构产物 —— 红藻氨酸（KA）和红藻氨酸内酯（KAL），更在 1.5 小时内完成全部分析，筛选效率较传统方法提升数百倍。团队最终成功识别出 7个性能优异的变体：不仅 KAL 生成效率较原始酶大幅提升，部分变体（如 SL44、SL306）的底物转化率突破 98%，解决了天然酶表达量低、稳定性差的行业难题。
三大研究亮点
赋能生物催化筛选
01
该研究的特色在于将捕集离子淌度（TIMS）技术带来的碰撞横截面积（CCS）信息引入生物催化筛选中， CCS 信息直接与离子的三维结构和体积特征相关，为 KA/KAL 这类结构细微差异的异构体提供了更具特异性的识别指标。布鲁克TIMS 技术以气体为推动力、电场为阻力，通过调控电场实现不同尺寸离子的高效分离和高灵敏检测（如图1A所示）。实验通过降低电场变化梯度和缩小淌度扫描范围，对 KA 和 KAL（实测CCS值：KA 147.7 Å2、 KAL: 152.0 Å2）实现了完全分辨（如图1B所示）。同时结合 timsTOF MPP 平台特色的 PRM-PASEF 扫描模式实现四极杆离子筛选与 TIMS 分离同步，有效过滤了大肠杆菌菌落、培养基等复杂生物体系中的背景化学噪声，为目标物的高灵敏检测和定量分析奠定了基础（如图1D所示）。
02
MALDI 离子化：
极简前处理 + 超高通量
在传统的筛选方法中，电喷雾电离（ESI）是常用的质谱电离技术，而 ESI 对样品的洁净程度有很高的要求，因此常需要纯化、萃取等繁琐前处理。本文创新采用了 MALDI 离子化技术，依托其对盐类、污染物的高耐受性，实现无需样品前处理、直接对大肠杆菌菌落进行原位分析，大幅简化生物催化筛选的实验流程。
在 timsTOF MPP 平台 10kHz 激光器的加持下，单样本分析仅需 5 秒，318 个酶变体筛选耗时＜30 分钟，1054 个 KabC 基因多样化变体全分析仅需 1.5 小时，较传统 LC-MS（单样本最长 15 分钟）效率提升数百倍。同时研究发现，MALDI 离子化对 KA 和 KAL 具备接近相同的电离效率，而 ESI 离子化下二者电离效率差异显著（如图1C所示），为后续的半定量分析提供了稳定、可靠的技术基础。
图1：KA 与 KAL 的 MALDI‑TIMS‑MS 分析方法优化（A）TIMS工作原理示意图。（B）KA 与 KAL 的 TIMS 分辨率优化。降低电压变化梯度和缩小淌度扫描范围，使得分辨率达到最优。（C）MALDI‑TIMS‑MS 与 ESI‑TIMS‑MS 测定 KA 和 KAL 相对丰度的对比。在对同一标准品混合物进行检测时发现，ESI‑TIMS‑MS 中 KAL 的相对信号强度降低了 65%，表明 MALDI‑TIMS‑MS 更适用于两者的相对定量分析。（D）采用 PRM‑PASEF 扫描模式可显著降低谱图的化学噪声。
03
MALDI 成像：
助力表达条件优化和异构体含量实时监控
近年来，MALDI 成像技术凭借独有的空间分布信息表征能力，成为突破传统分析技术局限的关键，研究团队首次将其整合至生物催化高通量筛选流程中，实现对大肠杆菌菌落中 KA、KAL 的原位实时空间监测与精准半定量分析。
实验首先对将大肠杆菌菌落在琼脂板点样与培养，再将含培养好的菌落的琼脂转移至MALDI靶板，通过提取目标离子的信号强度，从而确定了不加 IPTG+37℃ 培养 10h→30℃ 培养 6h，是琼脂板上酶高效表达和产物生成的最优条件（如图2A所示）。
为将成像方法转化为高通量筛选模式，还进行了菌落直接点样优化：将大肠杆菌菌液均匀涂布于琼脂板形成单菌落，用无菌牙签将单菌落直接转移至 MALDI 靶板并均匀铺展，干燥后用基质喷涂仪喷涂基质，替代琼脂块转移，进一步简化流程、适配大规模筛选。
最后基于优化好的 MALDI-TIMS-MSI 方法实现 KA/KAL 的空间分辨，实验证明 Y347F 突变体菌落的 KAL 相对丰度显著高于野生型 DsKabC（如图 2B 所示），与 LC-MS 验证结果一致（Y347F 的 KAL 产量比野生型高 7%），验证了成像数据的可靠性。
图2：A）基于 MALDI 成像对琼脂板上培养条件的优化；B）基于 MALDI 成像对表达野生型 DsKabC 或 Y347F 突变体的大肠杆菌中 KA 和 KAL 异构体的空间分布与半定量分析。
最终研究团队基于timsTOF MPP平台对总计 1054 个 KabC 变体进行筛选，筛选出 7 个 KAL 生成能力提升的嵌合酶变体，并后续进行了纯化和体外表达验证。
核心优势
布鲁克 timsTOF MPP 高通量筛选方案
如今，生物催化正朝着绿色、高效、规模化的方向加速发展，对筛选技术的通量、分辨率、特异性要求日益严苛。布鲁克 timsTOF MPP 高通量筛选方案，凭借技术创新与平台优势，开启非标记超高通量生物催化筛选新纪元，核心优势体现在三方面：
技术融合，提升分析专属性：在高通量筛选（HTS）流程中创新融合 TIMS 技术，通过分子碰撞截面实现同重素甚至异构体的快速气相分离，与常规 50,000 质量分辨率（高采集速率下）的 QTOF-MS 检测相结合，可在 HTS 高速分析的同时，实现分析专属性的质的提升。
硬件升级，兼顾通量与检测范围：配备 MALDI/ESI 双离子源和行业先进的 10 kHz smartbeam™ 3D 激光器，可实现与超高通量筛选（uHTS）兼容的速度和通量，同时提供独特的 MALDI-2 选项，有效扩大化学物质检测范围，适配更多生物催化研究场景。
软件适配，实现全流程自动化：MALDI PharmaPulse® 软件专为药物发现、生物催化等领域的 HTS 应用设计，其自动化接口允许在高通量环境中无缝集成 timsTOF MPP，并与不同供应商的通用调度软件协同工作；同时可将数据和结果无缝传输到 Genedata Screener® 等下游分析软件，实现从样本检测到数据解析的全流程自动化。
生物催化研究的核心，在于快速从海量变体中找到“最优解”。布鲁克 timsTOF MPP 高通量筛选方案，以 5 秒/样本的超高通量、精准的同分异构体分辨能力、极简的样品前处理流程，彻底改变传统生物催化筛选的效率瓶颈，让科研人员告别“漫长等待”，拥抱酶变体发现的“极速时代”。
参考文献：
Shepherd, Robert A. et al. Cell Reports Physical Science, Volume 0, Issue 0, 103092
