γ-PGA是一种阴离子大分子，可作为可持续絮凝剂/螯合剂

使用三种溶剂（丙酮、乙醇和甲醇）从三种纳豆中提取γ-PGA，通过实验测试观察到，肉汤与溶剂的最佳比例为1：4（v/v）。在15 mL试管中，加入3 mL提取的肉汤，然后加入12 mL冷冻溶剂。随着溶剂的加入，观察到γ-PGA存在的净特性的瞬时形成。然后将两个样品静置，一个静置40分钟，另一个静置12小时，均在约5°C的冷藏下。在每个周期结束时，将样品离心（30分钟，3600rpm），弃去上清液。沉淀用3mL超纯水重新溶解，然后用溶剂再次进行萃取阶段，弃去上清液，用超纯水溶解，该过程结束时得到溶液中的γ-PGA。所有实验一式三份。反应由2mL γ-PGA提取液、8mL pH7磷酸盐缓冲液和2mL十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）组成，并加入NaCl 溶液。将混合物在200rpm和30°C下在恒温浴中搅拌20分钟。为了确定γ-PGA浓度，在400nm处测量溶液的等分试样，并通过分光光度法构建校准曲线来计算γ-PGA的量。校准曲线由与CTAB络合构建，包括制备200mg/L的储备溶液γ-PGA。从浓度为5、10、15、20、25、30和50 mg/L的储备溶液中制备一系列标准品。

每公斤纳豆的γ-PGA产量分别为4.5、3.7和3.97N1、N2和N3，与固态发酵相比，本研究中使用的商业纳豆显示出较低的γ-PGA产量。在生产γ-PGA的研究方法控制了发酵过程中的决定性参数，并添加了矿物盐和氮源等营养物质，这些营养物质负责增加生物聚合物生产中的细菌作用。就纳豆而言，由于它是一种不以生产γ-PGA为目的的食品，因此这些生产参数不受控制，导致生物制品的产量较低。

图 1.枯草芽孢杆菌（纳豆）发酵前后的大豆显示出γ-PGA存在的特征粘度

图 2.γ-PGA的沉淀

在水溶液中，γ-PGA被阴离子生物聚合物与极化水分子正端之间的分子间吸引力溶剂化。将有机溶剂添加到从纳豆中提取的肉汤中的那一刻，立即形成“网”，这是γ-PGA沉淀的特征（图3）。聚合物压缩区和网是通过分子间静电排斥形成的。有机溶剂在加入溶液时具有比水更低的介电常数，因此降低了水的溶剂化能力，导致γ-PGA链的压缩。单体聚集成大分子是由于溶剂的排除，即聚合分子内力占上风。

图 3.使用溶剂在溶液中存在γ-PGA的瞬时净形成特征：（A）丙酮；（B）乙醇；（C）甲醇

在初始网络形成后，生物聚合物链继续发生压缩，导致沉淀的致密质量。温度也是γ-PGA沉淀以及其余制冷时间的决定性参数（图2b）。可以观察到在冷却40分钟和12小时延长时间内进行的提取的差异。采用冷藏隔夜的生物聚合物产率增加了46.27%的甲醇，52.25%的乙醇，14.25%的丙酮作为沉淀剂。在无溶剂存在和低温下，聚合物链占据的体积趋于减小，促进了沉淀过程，这是在本研究中观察到的。与40分钟相比，在使用三种溶剂的三种纳豆中，在12小时休息时提取的γ-PGA量的百分比增加百分比为正，但只有纳豆N除外3，在使用丙酮的提取中显示负百分比值，表明在这种情况下，40分钟的提取优于12小时的提取（图 2c）。

与其他溶剂相比，甲醇在冷藏过夜后对γ-PGA的萃取率更高。然而，与其他溶剂相比，乙醇在这种情况下表现出更高的效率比例增加。与乙醇和丙酮相比，甲醇是一种有毒溶剂，具有很高的操作风险。在冷藏中较长时间的静置能够提高乙醇的效率，乙醇在提取γ-PGA时应被视为一种环保溶剂。在冷藏萃取12h后，使用不同溶剂沉淀γ-PGA的处理的统计学意义时，采用了方差分析。结果表明，乙醇、甲醇和丙酮的方差分析导致三种纳豆的F值高于临界F值。P值表示溶剂组之间的差异是真实差异而不是偶然差异的显著概率，因为在纳豆的三次方差分析中，P值为<0.05，代表了本实验中给出的结果的良好可靠性。

表1显示了在FTIR中观察到的标准γ-PGA的条带（图4a）和从纳豆N中提取γ-PGA后获得的生物产物与甲醇（图4c）。

图 4.γ-PGA的红外光谱

FTIR光谱中存在的酰胺I条带是γ-PGA的特征，其中氨基酸通过γ-氨基连接，这是pH接近中性的特征。用于光谱分析的干燥和样品制备。因此，纳豆N1的γ-PGA光谱允许鉴定酰胺和羰基和羧基的特征峰的存在，这些基团是聚电解质絮凝过程中的功能性和优先基团。

对于纳豆N1的光谱 (图4b），指示峰在1238.9至729.682cm范围内归因于大豆籽粒中碳水化合物成分的存在，而脂质基团的鉴定范围为1542.76cm，γ-PGA的存在由波段1656.43cm的吸收表示，指酰胺I，拉伸带Cdouble bondO在1745.78cm的长度，拉伸带是指 1159.9cm处的 C-N−1和拉伸带在3438.14cm，指羟基。可以通过红外光谱分析来鉴定肽基团。肽键的分数可以通过分析酰胺I条带（1600-1700 cm)，酰胺在中红外区域的吸收允许识别二级结构。

γ-PGA可以以五种不同的构象出现，这取决于发现生物聚合物的环境条件。根据酰胺中二级结构的鉴定，吸收范围为1648-1660cm是α螺旋形状结构构象的特征。在提取过程之前，纳豆N1中存在γ-PGA在1656.43cm的波段中呈现其光谱延伸，因此表明其结构构象是α螺旋形的。这种构象发生在酸性pH值下，适用于离子很少或没有离子的γ-PGA分子。γ-PGA侧基的电离可以通过红外分析进行鉴定。对于γ-PGA，使用甲醇提取方法后，可以识别羧基COO的横向电离特征带通过光谱在波段 1592.54cm，而对于纳豆N1，γ-PGA在提取前不显示羧基电离的特征峰，而是以其氘代形式，在峰1745.78cm处鉴定，侧基的电离负责影响γ-PGA的结构构象，并与培养基和温度的pH值直接相关。

在纳豆N1的FTIR中，酰胺I键的特征峰长度为1656.43cm，在 γ-PGA 中提取N1后使用甲醇，在1633.73cm的波段内鉴定出酰胺I基团，酰胺I的这些吸收值，以及指示羧基侧基的电离值，使我们能够推断γ-PGA的结构构象在提取纳豆N1的过程后发生了变化（表2）。

从丙酮、乙醇和甲醇中提取的γ-PGA的絮凝行为相似（图5），但从甲醇中提取的γ-PGA的絮凝活性略好。如图5所示，絮凝剂活性的最佳浓度为10mg/L，显示以下值的减少。这种行为在所使用的三种溶剂上是相似的，其中显示最高效率的浓度为10mg/L对于三种溶剂。该浓度下，甲醇萃取γ-PGA的絮凝率为92.9%，丙酮为92.4%，乙醇为89.52%。

图 5.γ-PGA萃取过程中溶剂的变化所呈现的行为，用于絮凝过程和标准γ-PGA

对于不同的pH值范围，γ-PGA以不同的方式呈现其结构构象链。该因素在絮凝体的形成中起决定性作用，因为它会干扰链上的自由电荷，这些自由电荷可用于在胶体之间形成桥梁，从而使絮凝过程成为可能。在酸性pH值小于3时，γ-PGA以酸性形式存在，并且由于强氢键而具有疏水性，因此，在pH值小于3时不进行测试。在25°C的室温下，在含有生物聚合物且具有酸性pH（小于4.5）的溶液中，γ-PGA呈α螺旋构象，通过分子内氢键稳定。在pH大于6.5时，γ-PGA分子仅存在于线性随机链构象中，这使得γ-PGA具有更大的功能来结合其表面的阳离子分子，如图6所示。

图 6.从N中提取的γ-PGA的絮凝速率和粘度1使用甲醇作为沉淀剂

纳豆N1使用甲醇作为溶剂的粘度值最高（表3）。在测试的三种纳豆中，N1是γ-PGA含量最高的产品，甲醇在提取过程中的效率最高。使用甲醇作为沉淀剂可能影响了溶液的剪切速率。由于粘度与溶液中存在的溶质的分子量有内在的联系，由于分子量越大意味着粘度的阻力越大，因此该分析的结果使我们能够推断出在纳豆N1的情况下，γ-PGA的分子量可能比其他两种研究的纳豆具有更高的值。

在不同pH值范围内γ-PGA萃取的粘度分析中，随着pH值的增加，黏度值越高。在酸性形式下，在低pH值下，由于分子内氢键强，γ-PGA呈联合化的游离酸形式。随着pH值的增加，这些氢键被破坏，分子的羧基被转化为阴离子基团。当达到pH值6或高于此值时，分子的羧基被电离，也就是说，pH值的增加导致在γ-PGA存在下具有更大的溶解度以及粘度，随后这种增加直到达到 pH8，如图5所示。

总  结