Olink蛋白质组学技术是目前市面上应用较为成熟，成果也较为亮眼的基于临近延伸分析技术而诞生的高通量蛋白质组学检测的解决方案。凭借其超敏、微量、有利于中低丰度蛋白检出等优势，常应用于医学转化、临床疾病研究、生物学基础研究、药物应用开发等领域。为了让大家更直观的了解Olink技术的应用方向和成果，我们收集了相关文献16篇进行简要分析，具体分为综述、应用开发、精准医学应用、后GWAS(全基因组关联研究)的蛋白遗传学、免疫系统与mRNA疫苗五个部分，供大家参考学习。
KEY：综述
文章标题：
Genetics meets proteomics: perspectives for large population-based studies
杂志信息：Nature Reviews Genetics
发表年份：2020
影响因子：53.24
文章简介：本篇综述回顾了当前血浆蛋白质组的研究发现，重点介绍了目前能够在大样本人群研究中对血液循环蛋白质组进行分析的大规模蛋白质组学技术。
OLINK：高通量蛋白组学技术
大规模人群研究中捕获循环蛋白的主要技术：
①质谱（MS）：质谱（MS）是蛋白质组学中最常用的技术，主要被用于产生用于鉴定和定量蛋白质的肽。MS中有两种互补的肽段测量方法，一是靶向MS，使用稳定同位素标准肽作为参考点以对样品中的肽进行绝对定量；二是非靶向MS，数据依赖型采集（DDA）MS方法，可在3小时内测量10个血浆样品中的近300种蛋白质。
②基于亲和力的方法，包括：基于抗体的多重免疫测定（Luminex和Olink）与基于核酸适配体的免疫分析（SomaScan）。Olink是通过用互补DNA标签修饰抗体来利用双重识别，在与共同靶标紧密结合时，两种结合剂的标签可以被延伸，并且DNA被扩增，随后是基于定量PCR的读数报告蛋白质丰度。SomaScan是基于溶液中蛋白质的捕获，随后是标记和纯化，通过选择具有延长的脱速率结合动力学的结合分子提高测定的选择性，然后将荧光DNA适体与DNA芯片杂交以进行检测。
KEY：开发液态活检生物标志物
文章标题：
Large-scale plasma proteomic profiling identifies a high-performance biomarker panel for Alzheimer’s disease screening and staging
杂志信息：Alzheimers & Dementia
发表年份：2021
影响因子：21.566
文章简介：血液蛋白正在成为阿尔茨海默病（AD）的候选生物标志物。在这项研究中，研究者使用了Olink的邻近延伸分析（PEA）技术来系统地评估AD血浆的蛋白质图谱。利用Olink的PEA技术分析1160个蛋白，系统研究AD的血浆蛋白质组，确定了一个包括19种血浆蛋白的AD生物标志物面板，并捕获AD血浆的整体蛋白质组谱，建立了一个高度准确的AD分类和疾病分期的整合模型。并基于中枢蛋白开发出一种用于AD分类和反应AD严重程度的生物标志物组合。
OLINK临近延伸分析技术 PEA
临近延伸分析技术（Proximity Extension Assay, PEA）是能够利用微量的血清、血浆或几乎任何其他类型的生物样本进行高通量、多重免疫检测。PEA技术结合了两种强大的科学技术：高特异性的抗体免疫分析和高灵敏度的聚合酶链式反应（PCR）。其检测原理基于抗体免疫分析和PCR或二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术，96个寡核苷酸抗体对中的每一对都包含唯一的DNA序列，只允许彼此杂交。随后的邻近延伸将创建96个唯一的DNA报告序列，这些序列将通过实时PCR进行扩增。多重免疫测定的限制因素是抗体的交叉反应，而该技术不会检测到交叉反应，因为只有匹配的DNA才能杂交产生用于NGS或实时qPCR的扩增子。
检测流程：
1、蛋白样本制备
2、抗体孵育及文库制备Olink蛋白Biomarker检测分为Target系列（48、96）和Explore系列（384、3072），Target系列使用qPCR的方式进行检测。Explore系列通过Illumina NGS方法进行检测。
3、蛋白检测：Target系列使用Olink Signature Q100 system完成高通量real-time qPCR检测，对蛋白进行定量。Explore系列可以使用IlluminaNextSeq 550、NextSeq2000、NovaSeq6000进行检测，根据对应的count值得到各蛋白Biomarker的相对含量。
qPCR方式：将制备好的蛋白样品根据不同目标panel蛋白浓度进行稀释，与连有寡核苷酸序列抗体共同孵育，连接到蛋白质上的两条寡核苷酸序列进行碱基互补配对后，在DNA聚合酶的作用下，配对寡核苷酸序列于反应体系中进行延伸，预扩增后进行PCR检测。
Illumina NGS方式：在DNA链互补配对延伸后，通过PCR对DNA barcode进行扩增（PCR1扩增），接着对每个样本都添加唯一的样本index，进行PCR2扩增，再添加测序接头进行文库制备，目的是保证panel会有一个单独的库。为保证文库质量，有效去除引物、引物二聚体、dNTPs和其他污染物，使用磁珠对样品进行纯化，经Bioanalyzer或Tapestation质检合格后，即可准备上机检测。
KEY：精准医学应用
文章标题：
①Immunologic markers and risk of hepatocellular carcinoma in hepatitis B virus- and hepatitis C virus-infected individuals
（Alimentary Pharmacology & Therapeutics/2021）
②Obesity alters pathology and treatment response in inflammatory disease（Nature/2022/IF42.78）
③Multiplex immune profiling reveals the role of serum immune proteomics in predicting response to preoperative chemotherapy of gastric cancer（Cell reports medicine/2023/IF14.3）
④Gut Microbiota-Targeted Diets Modulate Human Immune Status（Cell/2021/IF41.6）
⑤Multicenter phase II trial of Camrelizumab combined with Apatinib and Eribulin in heavily pretreated patients with advanced triple-negative breast cancer（Nature Communications/2022/IF17.69）
⑥Distinct immune signatures discriminate between asymptomatic and presymptomatic SARS-CoV-2pos subjects（Cell Research/2021/IF25.617）
文章简介：
①本研究为了更好解释免疫标志物与丙型肝炎病毒、慢性乙型肝炎病与肝细胞癌风险相关，研究人员对循环免疫标志物进行更全面的评估。
②本研究探讨了肥胖和代谢疾病如何影响免疫系统。
③本研究基于系统免疫水平，从新的角度去理解胃癌患者综合治疗疗效差异产生的原因和机制。
④本研究探讨了饮食对微生物组和免疫系统的影响，招募一般健康的成年人（n=39）参加为期10周的饮食干预，参与者被随机分为两组：高纤维饮食或高发酵食品饮食。
⑤本研究为多中心II期临床试验，旨在评估卡瑞利珠单抗、阿帕替尼和艾瑞布林三药联合方案在晚期三阴性乳腺癌（TNBC）患者中的疗效和安全性。
⑥本研究探讨了在SARS-CoV-2感染的所谓“沉默感染阶段”(SSIS)期间，无症状和前症状个体的免疫学特征。
实验设计：高效完成核心蛋白组检测和分析
①本研究使用高灵敏度和特异性PEA的Olink炎症蛋白panel和心脏代谢panel，对两个队列所收集的血浆进行蛋白表达水平检测。一是台湾慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者队列，抽样175名肝细胞癌患者，117例仅肝硬化，165例非肝硬化对照。二从台湾慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染者（揭示）队列中，我们包括94名HCC患者，68名仅肝硬化和100名非肝硬化对照。
②文章中使用Olink Target 96 Inflammation I、Olink Target 96 CVD II 和Olink Target 96 CVD III对特应性皮炎患者队列（n=59）的外周血样品进行生物标志物检测分析。发现肥胖者更有可能有TH17炎症的迹象，或预期的TH2炎症迹象减少。
③本研究使用Olink Target 96炎症panel，对胃癌患者治疗前和治疗后的92个标记蛋白的表达水平进行检测。
④本文使用Olink炎症panel靶向蛋白质组学，研究高纤维饮食对宿主免疫的影响，并对血液进行蛋白水平检测，发现高发酵食品干预会显著降低免疫细胞的特征蛋白质表达水平，炎症相关的92种蛋白质中，有19种表达水平降低。
⑤本研究使用Olink技术对血浆内的蛋白表达进行检测，确定潜在的血液生物标志物。
⑥本研究通过Olink技术系统检测了180种外周血血浆蛋白种类，系统描述SARS-CoV-2感染者分泌的炎症因子。研究发现包括与单核细胞相关的MMP-1, CLEC4A, LY75和STC1在内共7种炎症因子在持续无症状感染者和潜伏期无感染者中存在差异。
KEY：后GWAS时代的蛋白遗传学
（1）文章标题：
①Phenome-wide Mendelian randomization mapping the influence of the plasma proteome on complex diseases（Europe PMC Funders Group Author Manuscript/2021）
②Genetic Landscape of the ACE2 Coronavirus Receptor（Circulation/2022）
③Mapping the proteo-genomic convergence of human diseases（Science/2021）
文章简介：①阐述了人类蛋白质组是治疗靶点的主要来源。使用孟德尔随机化和共定位评估1002个蛋白质对225个表型的影响。使用了基因组和最先进的血浆蛋白质组技术检测，得到了 pQTL（工具变量）和血浆蛋白质组表达谱（暴露因素）以及疾病后果的大数据，进行了双样本孟德尔随机化实验（Two sample MR）。
②揭示ACE2（血管紧张素转换酶2）蛋白遗传图谱及与疾病因果联系。
③本研究通过大规模的蛋白质组学分析，探索了人类疾病的基因组学基础。
（2）文章标题：
④Plasma proteomic associations with genetics and health in the UK Biobank
⑤Rare variant associations with plasma protein levels in the UK Biobank
⑥Large-scale plasma proteomics comparisons through genetics and disease associations
杂志信息：Nature
发表年份：2023
影响因子：39.59
文章简介：研究团队利用英国生物库药物蛋白质组学项目（UKB-PPP）的数据，展示了迄今为止规模最大的蛋白质研究结果，为UKB参与者生成了最新的、最全面的血浆蛋白质组遗传图谱。其中，文章⑥Large-scale plasma proteomics comparisons through genetics and disease associations作为三篇Nature重磅之一的开创性文章，提供了迄今全球范围内最大规模的基于不同蛋白质组学平台检测数据的对比分析，为科学家们提供了更全面蛋白质组学视角，研究遗传学与疾病表型的关联。
OLINK孟德尔随机化（MR）研究逻辑
a、孟德尔随机化可在非随机对照实验（随机对照试验，RCT）实验数据中使用遗传变异来估计暴露（潜在的致病因素）与结局（疾病但不限于疾病）之间的因果关系。
b、暴露指假定的因果风险因素，亦称中间表型。
c、运用遗传信息作为工具变量具有优势：保证了各个混杂因素在遗传变异的不同分组之间的均衡分布，理论上避免了混杂因素的干扰。由遗传变异作为暴露的工具变量所解释的暴露变异也是先于结局的，避免了反向的因果关系错判。
d、MR模型：
遗传变异作为有效的工具变量需要满足核心假设：
（1）关联性:遗传变异 Z 与暴露 X 相关;
（2）独立性：遗传变异 Z 与影响“暴露-结局”关联的混杂因素 U 独立；
（3）排他性：遗传变异 Z 仅通过暴露 X 影响结局 Y。
e、建模后，利用孟德尔随机化的算法进行实际数据分析，为避免工具变量和暴露因素之间的相关性较弱，使最后的因果效应出现偏差。使用 pQTL 作为工具变量，血浆蛋白质丰度（可精确测量）为暴露因素，而全基因组关联分析的疾病表型或者后果作为结果进行建模。
pQTL ：是一种与血浆中循环蛋白丰度水平相关的遗传变异，如基因变异直接能在DNA 表达中起作用的称之为,顺式-pQTL(cis-pQTL)；如基因变异的位置和蛋白质在基因组中的基因座位置很远，称之为反式-pQTL (trans-pQTL)。
KEY：OLINK蛋白质组学与mRNA疫苗
（1）文章标题：
Systems vaccinology of the BNT162b2 mRNA vaccine in humans
杂志信息：Nature
发表年份：2021
影响因子：49.962
文章简介：本研究通过系统疫苗学方法，全面评估了56名健康志愿者接种辉瑞-生物科技（Pfizer-BioNTech）mRNA疫苗（BNT162b2）后的先天和适应性免疫反应。
OLINK方法
为了进一步了解疫苗接种后的先天免疫反应现象，使用Olink的炎症panel测量31名接种疫苗的个体的CXCL10 （a） 和 IL-10 （b） 的血浆水平，以及通过 SIMOA 测定的 IFNα2 血浆细胞因子。在检测到的 67 种细胞因子中，2 种细胞因子（IFNγ 和 CXCL10）的浓度在初次接种疫苗后第 1 天和第 2 天显著增加。
（2）文章标题：
Systemic immune profiling of Omicron-infected subjects inoculated with different doses of inactivated virus vaccine
杂志信息：Cell
发表年份：2023
影响因子：42.78
文章简介：该研究探讨了接种不同剂量灭活病毒疫苗如何影响Omicron变种感染者的免疫反应。
OLINK方法
使用 Olink 炎症组合和免疫反应组合对170个血浆样品进行测量，该组合涵盖 180 种独特的蛋白质生物标志物。该检测使用了两种匹配的寡核苷酸标记抗体，抗体与靶蛋白成对结合。当抗体对结合特异性抗原时，相应的寡核苷酸形成扩增子。
参考文献：
[1]Jiang Y, Zhou X, Ip FC, et al. Large-scale plasma proteomic profiling identifies a high-performance biomarker panel for Alzheimer's disease screening and staging. Alzheimers Dement. 2022;18(1):88-102. doi:10.1002/alz.12369
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[3]Zheng J, Haberland V, Baird D, et al. Phenome-wide Mendelian randomization mapping the influence of the plasma proteome on complex diseases. Nat Genet. 2020;52(10):1122-1131. doi:10.1038/s41588-020-0682-6
[4]Tang Z, Gu Y, Shi Z, et al. Multiplex immune profiling reveals the role of serum immune proteomics in predicting response to preoperative chemotherapy of gastric cancer. Cell Rep Med. 2023;4(2):100931. doi:10.1016/j.xcrm.2023.100931
[5]Yu S, Lin Y, Li Y, et al. Systemic immune profiling of Omicron-infected subjects inoculated with different doses of inactivated virus vaccine. Cell. 2023;186(21):4615-4631.e16. doi:10.1016/j.cell.2023.08.033
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[12] Liu J, Wang Y, Tian Z, et al. Multicenter phase II trial of Camrelizumab combined with Apatinib and Eribulin in heavily pretreated patients with advanced triple-negative breast cancer. Nat Commun. 2022;13(1):3011. Published 2022 May 31. doi:10.1038/s41467-022-30569-0
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[16] Yang Z, Macdonald-Dunlop E, Chen J, et al. Genetic Landscape of the ACE2 Coronavirus Receptor. Circulation. 2022;145(18):1398-1411. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.121.057888
撰写：繁星小组
审核：繁星小组
发布审核：詹祺然