蔡司光学课 | 如何避免显微成像拼图时出现拼痕/阴影

随着生命科学研究水平的不断提高，研究者们都希望在看到样品高分辨细节的同时，获得样品的全貌，这样既获得结构信息，又能获得空间信息。但由于高分辨物镜的视野通常都较小，大部分时候只能拍到局部。

因此需要通过拼图功能，才能在获得高分辨细节同时，观察到样品的全貌。无论你是做拼图成像的新手还是老手，可能时不时会遇到如下图严重的阴影以及拼痕。

▲ 污染物镜 (A) 不仅会使图像模糊，而且还会导致照明不均匀；清洁后的物镜 (B) 既能获得清晰锐利的图像，而且视野没有暗角。

▲ 蔡司研究级正置显微镜上减光片的位置，通常有1 – 6档，可以通过手动或者电动转轮调节。

宽场显微镜使用相机采集图像。当成像视野大于相机芯片的时候，就会出现暗角，最终导致拼图产生阴影，因此确保使视野小于芯片大小是避免阴影的关键。

在宽场显微镜上，可以通过设置Acquisition ROI来改变成像视野大小。

由于不同相机芯片大小有别，很难给出一个通用的参考值，因此建议只要视野略小于相机大小即可。具体可以参照下图

▲ 图中黑色区域代表相机芯片，蓝色框代表视野大小。图中的蓝色框和黑色区域大小一样，代表视野和相机芯片大小一样。通过修改ROI数字，使得蓝色框（视野）略小于黑色区域（相机芯片）即可。

针孔的大小影响着可通过的光信号量，进而影响视野亮度。

针孔越小，视野越暗，则越容易出现拼痕。因此建议在做拼图成像的时候，pinhole不小于1，并且可以根据实际情况适当往上微调。

但是注意，针孔越大，光学分辨率越差，因此需要把握好平衡。

在蔡司激光共聚焦显微镜上，当放大倍数越小，视野则越大，也更加容易出现暗角。

因此建议在做拼图成像的时候，Zoom不小于1，并且可以根据实际情况适当往上微调。

但是注意，Zoom越大，视野越小，需要做的拼图数更多，成像时间更长，因此需要把握好平衡。

▲ 做拼图的时候共聚焦上需要确保针孔不小于1 Airy Unit，以及放大倍数不小于1。

无论是宽场还是共聚焦，拼图拍完后都必须进行拼接 (Stitching) 图像处理，使不同的拼图连接在一起，消除错位。

具体步骤：在ZEN Blue -> Image Processing -> 搜索”Stitching” -> 选择 “New Output” -> 点击Apply，即可生成一张拼接好的大视野图像。