最近蔡司君收到了一些用户在进行大视野拼图时遇到的视野明暗不均问题：
“哎！在做组织切片的时候，手滑了一下，导致样品不够平整，荧光拼图成像时图像明暗不均。由于样品珍贵且制样周期长、不易重新制样，拼图成像时还有补救的办法吗？”
“蔡司君，我在给贴壁细胞做大视野拼图的时候发现总会有一些区域的信号收集不全，有什么办法可以改善吗？”
不知道正在读这篇推送的你是否也遇到过相关的困扰。不要着急，这一期的蔡司光学课我们一起来看看如何使用共聚焦中的ZEN blue软件来解决类似的问题。
相信大家经常会用LSM 900/980（点击查看）做拼图或者多区域成像。不知道大家有没有留意过我们的Tiles工具栏中的“Focus Surface and Support Points”这个功能选项。
▲ Tiles工具菜单
什么是聚焦地图（Focus Map）？
当样品表面不平整或者培养皿/玻片有缺陷，样品不同位置的焦面高度不同。Focus Surface and Support Points 功能就是通过在拍摄区域中添加聚焦支撑点，形成该区域的聚焦地图（Focus Map），使得在成像过程中每个位置的焦面都有迹可寻。
▲ Focus Map工作原理示意图
如何使用Focus Map做大视野拼图？
1.勾选Tiles模块，在Tiles-Advanced Setup窗口左侧选择一种Tiles模式，绘制所需拼图的区域。
▲ 绘制拼图范围
2.在Focus Surface and Support Points中设置Support Points的数目与分布策略，点击Distribute。
▲ 设置Support Points
3.点击Focus Surface and Support Points中的“Verify”按钮对每个聚焦点的位置进行聚焦。Verify可以使用Autofocus或者Manual的方式。之后就可以进行正常拍摄了。
▲ 确定Support Points的焦面以形成Focus Surface
来看看对于不平整的样品，使用聚焦地图前后的成像结果的差别。
▲ AlexaFluor® 568 phalloidin标记的小鼠肠道切片(采用Plan-Apochromat 20X/0.8物镜拍摄，共116 tiles，比例尺：200μm).
可以看到，在使用常规拍摄方式的时候，由于制片或者样品材料本身有一些缺陷，不同位置的焦面高度不一致，导致不能完全捕获到小鼠肠道切片的全部荧光信号。而Focus Map很好的解决了此类问题，得到的结果信息完整。所以如果在拼图的时候遇到此类问题，不妨试试Focus Map的功能。
此外， Focus Map也可以很好地矫正由玻片缺陷带来的拼图问题。下图为大鼠海马神经元细胞的成像结果对比图。
▲ Cy3-Anti MAP2(HM-2)标记的大鼠海马神经元。样品由Stefanie Kaech博士与 Gary Banker博士提供。（共1334tiles）
“在接触Focus Map之前，我们拍脑片的时候通常都是选定区域、找到焦面后就开始采集图像。由于平台会面对各色的样品，对于一些制样有缺陷的样品（比如封片不平整）就经常会因为聚焦问题产生拼痕或者得到的图像明暗不均。蔡司LSM 900的Focus Map功能对我有很大的帮助。它在脑组织样品成像中通过添加聚焦点，可以帮助我们得到一张清晰、完整的大视野拼图，很大程度上提升了工作效率并改善了成像质量。”
江苏医药职业学院成像平台的丁婷玉老师
这里大家可能要有疑问了，明场成像可以使用Focus Map吗？答案是肯定的。而且这个功能不仅仅适用于共聚焦显微镜，只要有电动载物台和Tiles的高级模块，即使是宽场荧光显微镜也可以使用，是不是很方便呢！
看了Tiles的新玩法是不是觉得相见恨晚了呢？如果想了解更多干货知识，欢迎联系千江工程师，我们下一期蔡司光学课再见！