前言：
从与目的基因融合表达体内示踪，到基于荧光共振能量转移的蛋白互作分析，荧光蛋白的出现彻底改变了我们研究生命系统的能力，然而其发展却并非一蹴而就，不恰当的荧光蛋白选择更会给我们的研究带来困扰。接下来让我们以DsRed的“进化”史为例，看看如何选择合适的荧光蛋白。
点击索取蔡司荧光染料信息海报
野生型DsRed优缺点：
1999 年，研究人员发现了第一个已知的红色荧光蛋白drFP583(通常被称为DsRed)，为多色标记和荧光共振能量转移开辟了新视野。相比绿色荧光蛋白，DsRed具有激发和发射波长更长，多色成像时串扰少，细胞内成像背景低，利于活细胞成像等特点，被迅速关注。
但很快，人们发现野生型DsRed作为荧光标签存在诸多限制因素，使其作为蛋白质定位的用途非常有限。首当其冲便是成熟速度，野生型DsRed成熟缓慢。在成熟过程中先形成一个绿色发色团，进一步氧化才能形成红色发色团，这种“绿色状态”引入了信号串扰，限制了DsRed在多色实验中的应用。此外，DsRed是一种专性四聚体（如图1），有形成寡聚体的倾向，这种聚集可能会对细胞产生毒性，更重要的是影响融合蛋白的定位，妨碍对目的蛋白定位的判断。
（注：目前应用较多的是商业化DsRed，相较于野生型DsRed成熟速度快且寡聚化程度低。）
▲ 图1. 野生型DsRed四聚体结构
进化：
为了克服野生型DsRed成熟速度慢以及四聚化的缺陷，研究人员对其进行了一系列的分子改造。
▲ 图2. 野生型DsRed衍生突变体谱系
第一阶段，研究人员通过对野生型DsRed进行密码子优化及各种突变，相继获得DsRed2（商业化DsRed）、DsRed.T1(DsRed-Express)等突变体。在这一阶段的分子改造中，DsRed成熟时间被大大缩短。同时，这些突变虽显著降低了聚集的趋势，但仍能够形成四聚体。
克服DsRed四聚体形态的缺陷，是一项艰巨的任务。先是通过定点突变产生了非荧光单体，为了挽救荧光，以定向进化的方式，最终获得单体形式的DsRed，命名为mRFP1。快速成熟的mRFP1克服了许多关键问题，同时发射波长更长。然而，它仍存在局限性，包括较低的荧光强度、易漂白和发色团的不完全成熟。
曙光：
2004 年，在mRFP1的基础上，研究人员获得了一系列性能更强的突变体，发射波长范围覆盖 540nm到610nm。根据与其发射光谱相似颜色的常见水果，将这些突变体命名为“mFruits”系列，包括mHoneydew、mBanana、mOrange、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。
▲ 图3. 纯化的“mFruits”荧光蛋白及发射光谱，从左到右依次为mHoneydew、mBanana、mOrange、tdTomato、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry
“mFruits”系列中每个突变体各有特点，其中最值得注意的是mCherry。与mRFP1相比，mCherry的激发和发射波长更长(587 nm/610 nm)，荧光亮度更亮（EGFP的50%），成熟时间更短(半成熟时间约15 min)，光稳定性显著提高，不易漂白。研究表明，mCherry在N端和C端融合目的蛋白时，荧光蛋白活性和目标蛋白功能相互没有明显影响。
▲ 图4. mCherry分子结构
当然，在DsRed“进化”过程中，不乏一些特征鲜明的蛋白，荧光蛋白改造探索的脚步也远未停止。如tdTomato是迄今为止报道的最亮的荧光蛋白，使其能够在非常低的光照水平下应用于活细胞成像研究。mPlum具有mFruit 系列中最深的发射波长，具有良好的信噪比，可以用于组织成像等。
如何选择合适的荧光蛋白：
通过上面的例子我们了解到，尽管一些荧光蛋白有相似的发射波长，但其特点却不尽相同，那如何在研究中选择更适合的荧光蛋白呢？
1. 尽量选择单体结构的荧光蛋白与基因融合。避免寡聚化对目的基因定位造成“伪迹”。
2. 充分考虑荧光蛋白的光谱特征。进行多色荧光成像时，根据光谱范围灵活选择荧光蛋白，避免串色。大家可以通过蔡司Light Lab（iOS）查询荧光蛋白的光谱。
使用共聚焦进行多色动态成像时，如果所选荧光蛋白无法通过序列扫描或调整检测范围而准确区分。借助带有32通道检测器的蔡司激光共聚焦显微成像系统LSM 980（点击查看），我们能够通过一次扫描获得光谱信息并进行实时在线拆分，以高时间分辨率“还原”真实信息，让您专注于真正感兴趣的内容。
▲ 图6. 植物样品肌动蛋白动态成像，右图为光谱信息。
3. 荧光蛋白与融合目的蛋白的成熟时间要相对匹配。避免两者因成熟时间不同而无法准确标记。
4. 荧光亮度及稳定性。选择荧光强度高、稳定性好（抗漂白）的荧光蛋白可以帮助我们获得高质量数据，但某些情况下，弱启动子驱动的融合荧光蛋白的表达仍会导致信号较弱，难以检测。
蔡司共聚焦搭载的超高分辨率技术LSM Plus及Airyscan在提高分辨率的同时，大幅提高图像灵敏度，能够以极低的激光强度激发样品，减少光漂白，利于深层信号获取和长时间数据采集。
5. 目的基因N端或C端融合表达。如果目的蛋白在体内加工过程中N端折叠到内部，而荧光蛋白恰好融合在N端，则会导致荧光信号的丢失。对于融合的方向，如果没有能够参考的文献案例，分别连到目的蛋白的N端和C端进行观察判断不失为一个好的选择哦。
6. 选择经过密码子优化的荧光蛋白。目前大部分荧光蛋白都经过密码子优化，但当细胞种属较少见时，如果荧光蛋白表达量极低或不可见，仍需将其考虑在内。
▲ 附：常见荧光蛋白特性概览
点击索取蔡司荧光染料信息海报
以上就是选取荧光蛋白的一些注意事项，如果想了解更多相关内容，可以和我们当地的技术人员联系，也可以在评论区留言哦~~
参考文献
Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BNG, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp red fluorescent protein. Nature Biotechnology 22, 1567-72 (2004) .