荧光偏振法快速准确高通量检测IgG和含Fc段衍生物

荧光偏振法定量测定IgG的Valita™TITER分析原理示意图。96孔Valita™TITER微孔板的每个孔中预先包被了标记了荧光的可与IgG结合的多肽-蛋白G（A）。IgG样本结合于多肽上并通过荧光偏振和弥散（去偏振）进行测定（B）。

荧光偏振可以有效地分析分子大小的改变。“不动”的荧光基团在偏振光的激发下会发出与激发光相同偏振方向的荧光。然而，转动的荧光基团的荧光偏振方向与激发光偏振方向相比会有一定的改变。在溶液中小分子比大分子转动更快，因此，连接有荧光基团的分子大小的改变，可以通过荧光去偏振程度的大小来进行测定。所以，当标记有荧光的蛋白G在没有结合其它分子时，其转动快，去偏振更多，而结合了IgG则相反（大5倍）（图2）。这种偏振的改变应用于检测溶液中的IgG。荧光偏振（FP）通过用平行偏振方向的激发光照射溶液并在平行方向和垂直方向上测定发射荧光。FP就是这两个偏振荧光的归一化后的差别，通常用mP表示。

结果与讨论

图3的标准曲线（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有荧光偏振检测功能的多功能酶标仪（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita™TITER试剂盒绘制的。所有酶标仪所获得的结果都具备很高的稳定性。

图3：在CLARIOstar多功能酶标仪上用Valita™TITER构建的IgG定量标准曲线。误差线表示3个复孔的标准差

 

最后，我们用不同条件培养的样品，用Valita™TITER定量IgG的结果与用常规方法HPLC的结果进行对比。图4显示两种方法测定结果的相关性，显示两种定量方法都有很好的准确性，而Valita™TITER分析速度更快因其不需要繁琐的样本准备过程。

图4：Valita™TITER定量IgG的结果与常规HPLC的结果进行对比