大数跨境
首页
>
生殖系统中的细胞外囊泡的分离纯化和应用
>

生殖系统中的细胞外囊泡的分离纯化和应用

生殖系统中的细胞外囊泡的分离纯化和应用 进科驰安
2022-12-07
1
导读：简介：无论是在辅助生殖学，病毒学或其他学科上，内生殖道是细胞外囊泡的潜在宝库。在本文中，我们将讨论内生殖道中细胞外囊泡的分离纯化和应用。

   简介：无论是在辅助生殖学，病毒学或其他学科上，内生殖道是细胞外囊泡的潜在宝库。在本文中，我们将讨论内生殖道中细胞外囊泡的分离纯化和应用。

        监测和了解来自生殖道的生物液体的组成，不仅对促进人类生殖健康，而且对保护性农业的应用至关重要。例如，生物标志物可用于微调人类和动物辅助生殖技术(ART)的窗口期，从而提高ART的成功率。在鉴定有益于卵母细胞、胚胎或精子的生物液成分方面也是一样的，特别是如果这些成分是ART技术合适的辅助用剂。此外，这些生物液体可能是疾病诊断和了解生殖道疾病发病机制的关键。


        生物液体中最通用和最复杂的组成部分之一是细胞外囊泡 (EV)。EV是纳米级的脂双层囊泡，包含各种蛋白质、核酸和来自其起源细胞的小分子。这使得它们成为具有吸引力的生物标志物候选物，并成为起源细胞和目标细胞之间细胞间通信的有效介质。本文将重点讨论来源于卵泡液、输卵管液、子宫液和阴道液的细胞外囊泡的分离纯化和相关研究。


生殖道液体的组成


        如果你的目标是分离EV，了解生殖道液体和血浆之间的一般区别是有用的。不幸的是，这里讨论的大多数生物液都没有详细记录的生化组成，因此在这里我们对这些生物液体进行很有限的总蛋白、葡萄糖和钠含量比较(表1)。


        总蛋白作为EV分离的最关键潜在污染物，是需要考虑的重要成分。虽然输卵管、子宫和阴道液体的蛋白质浓度都约为血浆总蛋白质浓度的一半，但在这些生物液体中，EV浓度和EV与蛋白质的比例尚未完全确定。

表1. 人类生殖道液体的成分比较。数值表示与血浆相比，每种生物液体的近似倍数变化。改编自[1-8]。

从生殖道液体中分离EV的注意事项

        迄今为止，尚未对生殖道液体的EV分离方法进行广泛研究；因此，目前没有足够的数据来推荐阴道液体的EV分离方法。然而，2021年的一项研究比较了子宫液体[9]的EV分离方法，并确定使用qEV尺寸排阻柱(qEVoriginal)(SEC是所考虑的选项中表现最好的，qEV纯化柱的分离物提供干净的电镜照片，蛋白质污染低，EV标记物CD9，TSG101和flotilin-1 富集良好 [9]。另一项卵泡和输卵管液EV的研究比较了qEV纯化柱和密度梯度超离心(DG-UC)，发现尽管EV大小和浓度没有差异，但DG-UC分离EV培养的囊胚质量优于qEV分离EV培养的囊胚 [10]。然而，这项研究并没有确定EV或一同分离下来的蛋白质是否导致了这种差异。这一点尤其重要，因为尺寸排除色谱法可以分离功能活跃状态的EV，这使得囊胚质量的差异不太可能是由于EV功能的差异，而更可能是由分离出的EV的特定亚群或者DG-UC分离中非EV结构的污染物造成了这种差异 [11]。MISEV指南建议对不含EV馏分进行功能测试，以确保在EV富集馏分中看到的任何影响都是由于EV，而不是其他组成成分造成的 [12]。为了真正衡量最有效的EV分离方法，建议使用EV大小、纯度(即低蛋白质污染)和形态作为分离成功的衡量标准。


生殖道EV的功能生物学和生物标志物潜能


        卵泡液是卵泡中含有的液体，卵母细胞在卵泡中成熟。在卵泡发育过程中，从含有未成熟卵母细胞的小卵泡到含有成熟卵母细胞的大卵泡(见图1)，从卵泡液中分离出的EV的含量发生变化 [13-15]。这与小卵泡分泌的EV促进颗粒细胞(围绕着卵母细胞产生激素的细胞)增殖的能力增强有关，可能反映了它们在卵泡发育中的作用 [14]。

图1. 生殖道示意图，标记处为目前研究感兴趣的分离EV的位置。


        从医学和农业的角度来看，卵泡细胞的EV可用于ART治疗，因为从卵泡液中分离出的卵泡EV可促进冷冻保存后解冻的卵母细胞减数分裂能力的恢复 [16]。这在保存卵母细胞方面也可能特别重要，因为卵母细胞可能必须被低温保存很长一段时间，直到找到适合受精的精子。


        输卵管液是输卵管内的液体，卵母细胞通过输卵管与精子相遇，受精和早期胚胎发育也在输卵管内发生。在整个发情周期中，EV的含量会发生变化——例如已经报道的EV内部的RNA、蛋白质和小分子 [17-18]。这一变化的部分原因是EV能量底物和参与能量生产的酶的增加，这些酶可被输送到胚胎中以帮助其生长 [17]。对于ART治疗，包括用于农业、保育和人类生育的ART治疗，输卵管液EV可能特别重要。输卵管液EV可以改善体外胚胎质量和发育[19-22]，甚至可以提高小鼠的出生率 [20]。对于精子，通过输卵管到达卵母细胞，输卵管EV已被证明可以提高精子获能(例如，受精所需的精子成熟阶段)，活力和流动性 [23-26]。这表明，在需要模拟生理条件的ART治疗中，输卵管液EV可能特别有用。


        对子宫液EV的兴趣主要集中在胚胎成熟到着床的过程中。这一阶段涉及到胚胎和子宫内膜(即子宫内膜)之间的双向交流。从子宫液中分离出的EV可能参与妊娠的识别，在妊娠15-17天的子宫液EV中存在胚胎来源的CAPG(妊娠信号识别 [27])。在体外，子宫EV已被证明能增加囊胚的形成和孵化(即着床的必要步骤) [29]。相反，子宫内膜炎奶牛的子宫液EV抑制囊胚发育 [30]。其他研究表明，子宫液EV可能有助于胚胎着床，可能通过涉及干扰素tau的机制 [31-34]。综上所述，这些研究表明子宫液体EV对于胚胎发育和着床后期的双向通信很重要，提示可能在ART治疗中使用。


        阴道液体EV可在阴道冲洗后从液体和粘液组分中的一种或两种中回收。有趣的是，这些EV可能有助于寻找子宫内膜异位症的诊断试验，这种疾病平均需要7年才能诊断出来 [35]。一项对自发出现子宫内膜异位症的猕猴的早期研究发现，阴道液中的EV浓度显著降低 [36]。虽然这还不足以用于诊断性测试，但它确实为子宫内膜异位症中阴道EV的改变的研究带来了希望，从而提供了一种可获得的诊断性测试。


        阴道EV也可用于宫颈癌诊断，因为发现宫颈癌患者阴道液EV中miR-21和miR-146a这两种miRNA增加 [37]。在病毒感染中也可看到阴道液体EV的变化，特别是EV miRNA在宫颈癌的致病感染、人乳头瘤病毒(HPV)和主要影响非人灵长类动物的艾滋病毒(HIV)的近亲，猴免疫缺陷病毒(SIV)，的感染中发生改变 [38,39]。在SIV及其人类同类HIV中，阴道EV也被发现具有抗病毒作用，减少病毒复制 [39,40]。这可能会对性获得性艾滋病病毒感染的预防性治疗的发展产生影响，需要进一步的研究。


生殖道液体EV研究的关键问题


        为了促进生殖道液体中EV相关研究的发展，仍有几个关键问题有待解决：


1. 生殖道液的生化成分是什么?

        对这些液体的分析研究仍远远低于大多数生物液体。这一信息将有助于优化生殖道液体中EV分离纯化，特别是在诊断或治疗方面。这对于阴道液体尤其重要，因为阴道液体的黏度可能会影响EV的恢复率。


2. 生殖道EV如何在解剖位置之间进行比较?

‍        例如，子宫EV的潜在诊断变化是否可反映在阴道EV中？如果是这样的话，这可以减少诊断测试的侵入性。


3.基于EV的子宫容受性和妊娠识别测试在农业上应用可行吗?

‍        为了对子宫容受性和妊娠识别进行快速诊断，很可能需要在同一位置进行很多检测。这将需要用户使用便利的、标准化的商用EV分离纯化和下游诊断测试，以尽量减少产生的错误。像qEV这样的EV分离系统，包括优化的纯化柱与自动馏分收集器(AFC)的自动化配合，将是这种应用的理想选择。


4. EV是否可以进行除血液检测外的生殖道疾病检测?

        来自生殖道液体的EV已显示出作为疾病生物标志物的潜在来源的前景，但目前尚不清楚这些EV是否能优于针对相同疾病的循环中的潜在生物标志物。

        这一领域的研究表明，生殖道液体EV在从医学到农业和环境保护等各个领域可能具有多么大的价值。这使得该领域的研究不仅可能对人类健康产生革命性影响，而且对全球农业也具有潜在的极高价值。



参考文献

  1. Shalgi, R., Soferman, N. & Kraicer, P. F. Gases and electrolytes of human follicular fluid. Journal of Reproduction and Fertility 28, 335-& (1972).  

  2. Velazquez, A., Reyes, A., Chargoy, J. & Rosado, A. Amino acid and protein concentrations of human follicular fluid. Fertility and Sterility 28, 96-100 (1977).  

  3. Killian, G. J., Chapman, D. A., Kavanaugh, J. F., Deaver, D. R. & Wiggin, H. B. Changes in phospholipids, cholesterol and protein content of oviduct fluid of cows during the oestrous cycle. J Reprod Fertil 86, 419-426 (1989). https://doi.org:10.1530/jrf.0.0860419

  4. Gardner, D. K., Lane, M., Calderon, I. & Leeton, J. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: Metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells. Fertility and Sterility 65, 349-353 (1996). https://doi.org:10.1016/s0015-0282(16)58097-2

  5. Lippes, J., Krasner, J., Alfonso, L. A., Dacalos, E. D. & Lucero, R. Human oviductal fluid proteins. Fertil Steril 36, 623-629 (1981). https://doi.org:10.1016/s0015-0282(16)45861-9

  6. Kermack, A. J. et al. Amino acid composition of human uterine fluid: association with age, lifestyle and gynaecological pathology. Human Reproduction 30, 917-924 (2015). https://doi.org:10.1093/humrep/dev008

  7. Ehrstrom, S., Yu, A. & Rylander, E. Glucose in vaginal secretions before and after oral glucose tolerance testing in women with and without recurrent vulvovaginal candidiasis. Obstetrics and Gynecology 108, 1432-1437 (2006). https://doi.org:10.1097/01.AOG.0000246800.38892.fc

  8. Wagner, G. & Levin, R. J. Electrolytes in vaginal fluid during the menstrual cycle of coitally active and inactive women. Journal of Reproduction and Fertility 60, 17-27 (1980).  

  9. Alminana, C. et al. Isolation and Characterization of Equine Uterine Extracellular Vesicles: A Comparative Methodological Study. International Journal of Molecular Sciences 22 (2021). https://doi.org:10.3390/ijms22020979

  10. Asaadi, A. et al. Extracellular Vesicles from Follicular and Ampullary Fluid Isolated by Density Gradient Ultracentrifugation Improve Bovine Embryo Development and Quality. International Journal of Molecular Sciences 22 (2021). https://doi.org:10.3390/ijms22020578

  11. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G. & Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine 13, 2061-2065 (2017). https://doi.org:10.1016/j.nano.2017.03.011

  12. Théry, C. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles 8, 1535750 (2019). https://doi.org:10.1080/20013078.2018.1535750

  13. Navakanitworakul, R. et al. Characterization and Small RNA Content of Extracellular Vesicles in Follicular Fluid of Developing Bovine Antral Follicles. Scientific Reports 6 (2016). https://doi.org:10.1038/srep25486

  14. Hung, W. T. et al. Stage-specific follicular extracellular vesicle uptake and regulation of bovine granulosa cell proliferation. Biology of Reproduction 97, 644-655 (2017). https://doi.org:10.1093/biolre/iox106

  15. Sohel, M. M. H. et al. Exosomal and Non-Exosomal Transport of Extra-Cellular microRNAs in Follicular Fluid: Implications for Bovine Oocyte Developmental Competence. Plos One 8, 16 (2013). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0078505

  16. Ferraz, M. et al. Follicular extracellular vesicles enhance meiotic resumption of domestic cat vitrified oocytes. Scientific Reports 10 (2020). https://doi.org:10.1038/s41598-020-65497-w

  17. Gatien, J. et al. Metabolomic Profile of Oviductal Extracellular Vesicles across the Estrous Cycle in Cattle. International Journal of Molecular Sciences 20 (2019). https://doi.org:10.3390/ijms20246339

  18. Alminana, C. et al. Deciphering the oviductal extracellular vesicles content across the estrous cycle: implications for the gametes-oviduct interactions and the environment of the potential embryo. Bmc Genomics 19 (2018). https://doi.org:10.1186/s12864-018-4982-5

  19. Lopera-Vasquez, R. et al. Extracellular Vesicles from BOEC in In Vitro Embryo Development and Quality. Plos One 11 (2016). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0148083

  20. Qu, P. X. et al. Extracellular vesicles derived from donor oviduct fluid improved birth rates after embryo transfer in mice. Reproduction Fertility and Development 31, 324-332 (2019). https://doi.org:10.1071/rd18203

  21. Qu, P. X. et al. Extracellular vesicles and melatonin benefit embryonic develop by regulating reactive oxygen species and 5-methylcytosine. Journal of Pineal Research 68 (2020). https://doi.org:10.1111/jpi.12635

  22. Alminana, C. et al. Oviduct extracellular vesicles protein content and their role during oviduct-embryo cross-talk. Reproduction 154, 253-268 (2017). https://doi.org:10.1530/rep-17-0054

  23. Franchi, A., Moreno-Irusta, A., Dominguez, E. M., Adre, A. J. & Giojalas, L. C. Extracellular vesicles from oviductal isthmus and ampulla stimulate the induced acrosome reaction and signaling events associated with capacitation in bovine spermatozoa. Journal of Cellular Biochemistry 121, 2877-2888 (2020). https://doi.org:10.1002/jcb.29522

  24. Ferraz, M., Nagashima, J. B., Noonan, M. J., Crosier, A. E. & Songsasen, N. Oviductal Extracellular Vesicles Improve Post-Thaw Sperm Function in Red Wolves and Cheetahs. International Journal of Molecular Sciences 21 (2020). https://doi.org:10.3390/ijms21103733

  25. Ferraz, M., Carothers, A., Dahal, R., Noonan, M. J. & Songsasen, N. Oviductal extracellular vesicles interact with the spermatozoon's head and mid-piece and improves its motility and fertilizing ability in the domestic cat. Scientific Reports 9 (2019). https://doi.org:10.1038/s41598-019-45857-x

  26. Alcantara-Neto, A. S. et al. Porcine oviductal extracellular vesicles interact with gametes and regulate sperm motility and survival. Theriogenology 155, 240-255 (2020). https://doi.org:10.1016/j.theriogenology.2020.05.043

  27. Tinning, H. et al. The role of CAPG in molecular communication between the embryo and the uterine endometrium: Is its function conserved in species with different implantation strategies? Faseb Journal 34, 11015-11029 (2020). https://doi.org:10.1096/fj.202000882RR

  28. Nakamura, K. et al. Induction of IFNT-Stimulated Genes by Conceptus-Derived Exosomes during the Attachment Period. Plos One 11 (2016). https://doi.org:10.1371/journal.pone.0158278

  29. Qiao, F. et al. Bovine uterus-derived exosomes improve developmental competence of somatic cell nuclear transfer embryos. Theriogenology 114, 199-205 (2018). https://doi.org:10.1016/j.theriogenology.2018.03.027

  30. Wang, X. G. et al. Exosome-derived uterine microRNAs isolated from cows with endometritis impede blastocyst development. Reproductive Biology 19, 204-209 (2019). https://doi.org:10.1016/j.repbio.2019.06.003

  31. Kusama, K. et al. Intrauterine exosomes are required for bovine conceptus implantation. Biochemical and Biophysical Research Communications 495, 1370-1375 (2018). https://doi.org:10.1016/j.bbrc.2017.11.176

  32. Ruiz-Gonzalez, I. et al. Exosomes, endogenous retroviruses and toll-like receptors: pregnancy recognition in ewes. Reproduction 149, 281-291 (2015). https://doi.org:10.1530/rep-14-0538

  33. Hua, R. W. et al. Small RNA-seq analysis of extracellular vesicles from porcine uterine flushing fluids during peri-implantation. Gene 766 (2021). https://doi.org:10.1016/j.gene.2020.145117

  34. Giacomini, E. et al. Global transcriptomic changes occur in uterine fluid-derived extracellular vesicles during the endometrial window for embryo implantation. Human Reproduction 36, 2249-2274 (2021). https://doi.org:10.1093/humrep/deab123

  35. Arruda, M. S., Petta, C. A., Abrao, M. S. & Benetti-Pinto, C. L. Time elapsed from onset of symptoms to diagnosis of endometriosis in a cohort study of Brazilian women. Human Reproduction 18, 756-759 (2003). https://doi.org:10.1093/humrep/deg136

  36. Muth, D. C. et al. Potential role of cervicovaginal extracellular particles in diagnosis of endometriosis. Bmc Veterinary Research 11 (2015). https://doi.org:10.1186/s12917-015-0513-7

  37. Liu, J. et al. Increased Exosomal MicroRNA-21 and MicroRNA-146a Levels in the Cervicovaginal Lavage Specimens of Patients with Cervical Cancer. International Journal of Molecular Sciences 15, 758-773 (2014). https://doi.org:10.3390/ijms15010758

  38. Wu, Y. et al. Changes of miRNA Expression Profiles from Cervical-Vaginal Fluid-Derived Exosomes in Response to HPV16 Infection. Biomed Research International 2020 (2020). https://doi.org:10.1155/2020/7046894

  39. Zhao, Z. Z. et al. miRNA profiling of primate cervicovaginal lavage and extracellular vesicles reveals miR-186-5p as a potential antiretroviral factor in macrophages. Febs Open Bio 10, 2021-2039 (2020). https://doi.org:10.1002/2211-5463.12952

  40. Smith, J. A. & Daniel, R. Human vaginal fluid contains exosomes that have an inhibitory effect on an early step of the HIV-1 life cycle. Aids 30, 2611-2616 (2016). https://doi.org:10.1097/qad.0000000000001236

Izon Science的Gen 2 qEV外泌体用尺寸排阻纯化柱，生产符合ISO13485认证，带给您纯净的外泌体，纯度可高达约1.0E+10个颗粒每ug蛋白 (1.0E+13个颗粒每mg蛋白，10mL人血浆上样量），如下图Gen 2 qEV10参数



转载来源：Izon Science


欢迎关注伯齐官方微信（微信公众号：Bio-Gene）

回复：视频，查看更多相关视频

长按/扫描以下二维码可识别关注公众号

伯齐科技有限公司

Bio-Gene Technology Ltd.

广州伯齐生物科技有限公司

热线：176 2009 3784

www.bio-gene.com.cn

marketing@bio-gene.com.cn

香港 北京 上海 广州 成都 济南


【声明】内容源于网络
0
0
进科驰安
内容 0
粉丝 0
进科驰安
总阅读0
粉丝0
内容0