内毒素：革兰氏阴性菌外膜的关键成分及其生物学功能

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的核心成分，对细菌的生存和适应至关重要。它不仅在细菌的结构稳定性中发挥着关键作用，还通过其与宿主免疫系统的互动，参与多种生物学反应。

本文将深入探讨内毒素的化学组成、功能、毒性及其在医学和药物行业中的重要性。

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什么是内毒素？

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要组成部分。通常，内毒素一词可与脂多糖（LPS）互用，尽管少数内毒素并非脂多糖。内毒素在细菌中的主要功能是结构性和保护性。

革兰氏阴性菌的特征是具有两层膜：内膜包裹细胞质，而外膜将细菌细胞壁与外界环境隔开。因此，外膜作为细菌抵御环境威胁的第一道防线。在大多数情况下，外膜并非普通的磷脂双层膜，而是由外层的脂多糖和内层的磷脂组成的不对称双层膜（图1）。

图1：革兰氏阴性菌具有内膜和外膜两层。外膜将细菌细胞壁与外界环境隔开，并含有脂多糖（LPS）或内毒素。

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内毒素的重要性

对人类和动物而言，内毒素属于致热原（发热诱因），即使微量（皮克级）进入血液循环也会引发多种生物反应。仅1毫克内毒素的静脉注射就可能致命。

在医药和医疗行业中，内毒素检测对于产品质量与安全至关重要。注射剂、生物制品（如胰岛素）及医疗植入物必须保持无菌。。然而，如果存在革兰氏阴性菌，灭菌过程中可能释放内毒素。内毒素具有热稳定性，即使细菌死亡后仍能持续存在。无论是沸煮还是高压灭菌均无法使其失活，但有研究表明次氯酸盐和过氧化物可使其失效。

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内毒素的化学组成

内毒素为两亲性分子，不同菌株的化学组成差异较大。内毒素分子量约为10 kDa，一般由三部分组成：含脂肪酸和二糖磷酸的脂质成分（Lipid A）、O特异性多糖侧链（O-抗原）以及核心多糖链（图2）。

图2：脂多糖（LPS）内毒素的基本结构

Lipid A是内毒素的毒性组分。它是磷酸化的N-乙酰葡糖胺二糖，包含疏水部分（脂肪酸的脂链），可将内毒素锚定在细菌膜中，其余部分突出于细胞表面（图1）。尽管结构高度保守，但可根据环境变化进行修饰。

图3：大肠杆菌内毒素Lipid A的化学结构。核心多糖由短链糖组成，不同细菌甚至不同菌株之间可能存在差异。

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内毒素的功能

内毒素是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，对细菌生存至关重要。它维持细菌结构完整性，并作为保护性两亲性屏障抵御化学攻击。内毒素形成的屏障仅允许低分子量亲水性分子通过，使革兰氏阴性菌对多种抗菌化合物具有耐受性。

在宿主体内，脂多糖能保护细菌免受吞噬细胞或血清成分的杀伤。值得注意的是，内毒素结构的变异形成了不同的抗原菌株，这增加了细菌规避先前针对特定菌株形成的免疫反应的机会，从而促进了耐药性的进化。

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毒性

由于内毒素暴露于细菌表面，先天免疫系统已进化出识别其威胁并作出反应的能力。当革兰氏阴性菌被免疫系统杀死时，其膜片段携带的内毒素释放入血液，可能引发发热和腹泻。血液中内毒素存在（内毒血症）通常导致低血压、呼吸衰竭和氧气输送减少。

作为LPS中最保守的部分，免疫系统主要针对Lipid A作出反应。免疫反应完全依赖先天免疫，由Toll样受体4（TLR4）与MD2复合物介导（图4）。

图4：TLR4（蓝色）-MD2（绿色）二聚体复合物与内毒素的Lipid A（红色）结合示意。TLR4跨膜结构示意。作者：David Goodsell

TLR4可刺激巨噬细胞和内皮细胞分泌促炎性细胞因子及一氧化氮。此外，内毒素还能促进B细胞分化、增殖及免疫球蛋白分泌（主要为IgG和IgM）。同时，补体和凝血级联被激活，引发炎症、血管扩张、中性粒细胞趋化、凝血、出血及休克。

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内毒素检测

内毒素检测方法多种多样。体外检测方法包括LAL实验和ELISA，可在酶标仪上进行，显著提高通量与效率。

马蹄蟹变形血细胞裂解物（LAL）实验是常用的内毒素检测方法。LAL检测基于从马蹄蟹血液中分离的变形血细胞提取物，可分为比色法或浊度法。亦有基于重组蛋白与荧光底物的替代LAL实验（图5）。更多信息请参阅我们的博客文章： “LAL检测：利用活化石探测细菌污染”

图5：荧光内毒素检测实验。荧光强度越高，内毒素含量越高。

所有内毒素检测均可在酶标仪上完成。这些方法通常需要吸收光酶标仪来探测显色反应（LAL及最典型的ELISA）或浊度变化。基于重组蛋白和荧光底物的检测则需使用荧光酶标仪。

BMG LABTECH旗下可用于内毒素定量的酶标仪包括：SPECTROstar Nano、Omega系列、VANTAstar、CLARIOstar Plus及PHERAstar FSX。