OD600：微生物生长测定的原理、应用和前景- 大数跨境

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OD600：微生物生长测定的原理、应用和前景

进科驰安

2024-02-01

导读：600nm波长处的光密度（OD600）可反映细菌和酵母等微生物的生长信息。更具体地说，反映种群中微生物数量随时间的变化情况。

600nm波长处的光密度（OD₆₀₀）可反映细菌和酵母等微生物的生长信息。更具体地说，反映种群中微生物数量随时间的变化情况。

微生物生生长曲线

监测微生物种群随时间的变化，可绘制出一条生长曲线（图1），分为四个生长阶段：

迟缓期

Lag phase

少量微生物被置入培养基（接种）开始培养后，需要一段时间适应新环境。在此期间不会发生分裂，种群密度保持不变。

对数期

Log phase

当微生物适应了新的环境，就会开始增殖。细胞数量在一段时间内以几何级数增加。对数期是微生物分裂最活跃的时期，可用于进一步计算倍增时间和生长速率等参数。

稳定期

Stationary phase

微生物的増殖受到培养基中营养物质的限制。一旦碳源或其他必需成分消耗殆尽，就会停止分裂。微生物生长曲线在这一阶段的特点表现为微生物种群密度稳定保持在较高水平。

衰亡期

Death phase

随着营养物质、盐、氨基酸的耗尽，以及酸或乙醇等有害废物的积累，微生物培养环境条件恶化，微生物种群开始衰亡。这表现为微生物密度整体呈下降趋势。

图1：微生物生长曲线。分批培养中微生物数量的典型变化过程。

利用OD₆₀₀测量微生物生长的原理

OD₆₀₀基于吸收光检测，测量的是穿过样品，即微生物悬液的光。透射光与微生物的生长有什么关系？由于溶液中的微粒会产生散射光，微粒（微生物）越多，散射的光就越多。因此，随着细菌或酵母数量成倍增长，光散射程度和测量的吸光度值会变大。同时，这意味着只是通过吸收光模式测定光散射的程度，而不是衡量分子对光的选择性吸收。这一点至关重要：OD₆₀₀实际上测量的是散射引起的透射光损失，而不是吸光度！

多种生物和医学研究领域都要用到有关微生物生长的信息：

抗生素耐药性

感染多重耐药病原体的人数和因感染而死亡的人数不断增加。亟需开发新型药物或方法，来控制这些病原体。在新抗菌药物的研发过程中，要用到OD₆₀₀评估其对微生物生长的抑制作用，以确定药物的有效性。

微生物生产

微生物本身可以成为工业产品，可用于生产烘焙食品或奶酪等，还可用于生产酶、抗生素、维生素等产品。对于这两种用途，都需要在过程初始对生长特性等方面进行菌种优化。生产过程一经建立，就需要进行微生物监测。同样，要用到OD₆₀₀监测过程中的微生物生长情况。

合成生物学

使用基因工程经典方法来构建具有预定特性的生物系统。这意味着要对生物 “机器”进行合理设计，包括对基因进行高度改造，甚至是改造成完全人工基因组。其目的是生产出石化产品替代品，如生物燃料或塑料，以及能感知污染物或降解塑料的微生物产品。常用的微生物有大肠杆菌（E. coli）和酿酒酵母菌（S. Cerevisiae）等，需要通过OD₆₀₀监测其生长情况。

用OD₆₀₀检测微生物生长的注意事项

如前所述，OD₆₀₀测量的是散射光，而非吸收光。理论上，描述吸光度与吸收分子浓度线性关系的朗伯-比尔定律不适用于OD₆₀₀测量。但实践证明，尽管不使用吸光度，比尔-朗伯定律仍适用于低密度培养物。换句话说，OD₆₀₀值可以直接与极低密度悬液中的微生物数量相关。对于密度较高的培养物，OD₆₀₀的测量结果呈抛物线状。只有将OD₆₀₀值与一系列微生物数量进行校准后，才能计算出这种培养物中的微生物数量。

选择比色皿还是微孔板？

如果要对大容量的样品进行过程监测，推荐使用比色皿。每隔一定时间（如1小时）取样一次，测定微生物的种群密度。每次检测需要约1.5ml微生物悬液，并且需要留出一定时间进行样品抽取（图2）。

图2：从酵母发酵罐中取样。

微孔板则用于微生物生长的持续监测。只需200µl悬液，以设定的时间间隔自动检测生长过程。通常使用的是96孔板，非常适合多种样品的重复测量，以及比较不同的培养基条件或菌株。对于中高通量应用，可实现流程自动化。

如何选择检测仪器？

以吸收光模式测定颗粒的光散射时，使用不同的仪器得出的结果可能会有所差异。原因在于光束的类型不同，探测器与样品的距离也不同。可以想象，当通过微生物的光束发生散射，距离较近的探测器更容易捕捉到光线，而距离较远的探测器则有可能捕捉不到（图3）。因此，建议使用可用OD₆₀₀来检测微生物生长过程的一系列专用仪器。

图3：不同的检测仪器会产生不同的结果。该图展示探测器位置的影响：在尺寸相同的情况下，距离样品较近的探测器可检测到散射光，而距离样品较远的探测器则检测不到光信号。

显然，比色皿或微孔板的使用限制了选择范围，二者分别对应分光光度计和酶标仪。但像SPECTROstar® Nano这种兼具比色皿和微孔板检测能力的仪器，可以满足您当下和未来的所有需求（图4）。

图4：BMG LABTECH的SPECTROstar® Nano是一款带有比色皿端口的酶标仪。

什么情况下需要校准？

如果需要用OD₆₀₀值来确定溶液中的微生物数量/浓度（如每毫升的微生物数量），或者需要对OD₆₀₀散射测量的非线性性质进行校正，需要进行校准。为了进行测量，需要制备已知微生物浓度的微生物悬浮液，并使用与后续实验相同的样品量在所选仪器上测量OD₆₀₀。用测量值生成校准曲线，随后可将未知样品的OD₆₀₀值与该曲线相关联，并反算出浓度。由于光散射会随着颗粒大小和形状的变化而变化，因此对每种微生物都要进行校准。同样，在更换分析仪器或样品量时也需要进行校准。

OD600测量的前景

利用微孔板测量OD₆₀₀的方法越来越多地与发光或荧光等检测模式相结合。微生物生长测量值可用于其他检测法的归一化处理。例如在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）期刊发表的一篇文章中，一项研究使用 CLARIOstar® 多功能酶标仪测量金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的翻译。使用荧光模式测量了β-半乳糖苷酶报告基因，并将表示酶活性的信号归一化为OD₆₀₀。另一个例子是使用化学发光法检测单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）基因表达，并将其归一化为OD₆₀₀值。

检测微生物生长的其他方法

散射比浊法

利用散射比浊法检测微生物生长也是基于光散射原理。与测量散射导致的透射损失的OD₆₀₀值不同，散射比浊法直接检测散射光。这是BMG LABTECH的NEPHELOstar® Plus（图5）的强项。与基于吸光度模式的方法相比，散射比浊法的灵敏度更高，可检测颗粒数量较低的样品，因此适用于检测微生物数量极少的悬液。