自发荧光从何而来，如何避免？- 大数跨境

进科驰安

2024-05-08

导读：Cell-based assays（CBA）已成为生命科学研究，尤其是药物发现领域不可替代的工具。

Cell-based assays（CBA）已成为生命科学研究，尤其是药物发现领域不可替代的工具。与生化分析法相比，基于细胞的方法保留了结构和生理背景，提供的数据具有更高的生物学相关性。然而，要获得这种附加值，通常需要付出更多的计划和准备工作。研究人员会发现，将实验设置好还不够，在测量时，往往会遇到一些有别于传统生化实验的影响因素。在本文中，我们主要探讨自发荧光干扰对CBA结果的潜在不利影响，以及解决的办法。

自发荧光的来源

在DNA荧光定量或ELISA检测中，目标荧光团通常要溶解在水或成分简单的缓冲溶液中。这些溶液主要由离子组成，所以只有微弱的自发荧光。而细胞检测有不同的要求，培养基通常含有碳水化合物、氨基酸以及各种激素，以维持细胞的新陈代谢过程，比如在细胞培养基内添加血清（如胎牛血清，FBS），为细胞提供所需的营养和信号通路分子。培养基中自发荧光大多是由具有芳香族侧链的分子引起的。这些侧链主要存在于FBS中的氨基酸和激素（图1A），以及主要作为pH指示剂添加的酚红（图1B）中。因此，添加FBS和酚红都会增加荧光测量的背景水平。

图1：细胞培养基补充剂的荧光发射光谱 A) 胎牛血清 (FBS) 的发射光谱 B) 含酚红的杜氏改良Eagle培养基 (DMEM) 的发射光谱。选择Ex360、450、482、530、580、 630是为了涵盖CBA法常用的染料/荧光团。

如何降低CBA中的自发荧光？

调整上清液

CBA的数据质量在很大程度上取决于所使用的培养基。信噪比（S/B）是衡量动态范围的重要指标。比值越高，就更有把握分辨出样本之间的微小差异。

在图2所示的例子中使用的是96孔板，每个样品孔接种50000个HeLa细胞，共10个重复。经过一夜的培养，使细胞贴壁并扩散到孔底，使用Hoechst 33352对细胞进行固定和染色。然后依次向孔中加入不同种类的培养基。对于每种培养基，在含有细胞的样品孔旁，对36个不含细胞的空白孔进行测量。从顶部测量细胞，激发波长为360nm，发射波长为460nm。如图2所示，在含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS+）中评估细胞时，S/B值最高。针对荧光检测进行调整和优化的培养基，如Fluoro-Brite™ ，是PBS+的理想替代品。与PBS+不同的是，培养基含有营养物质，这对于使用活细胞进行长期评估是不可或缺的。使用含有酚红的培养基，以及补充较多的血清（>5%），S/B比值会大幅降低。目前市面上已有不含酚红的标准细胞培养基。如果自发荧光的问题可追溯至上清液，可以使用此类培养基。

图2：培养基中加入引起自发荧光的成分，会使信噪比 (S/B)降低。

改用底部读取

另一种降低培养基对动态范围影响的方法是使用底部光学组件，也就是从板的下方进行激发和测量。这样一来，激发光和发射光就不必穿过细胞上方的上清液，限制了对培养基中自发荧光成分的激发，通常也会减少因非特异物质的散射或吸收而造成的光损失。

如图3所示，使用产生自发荧光的培养基时，底读法的优势尤为明显。在96孔板中，每个样品孔接种50000个表达RFP的HeLa细胞，共10个重复。经过一夜的培养，使细胞贴壁并扩散到孔底，然后依次向孔中加入不同的培养基，用顶部和底部光学组件分别在580nm波长和620nm波长处进行激发和发射测量。在含细胞孔旁，对于每种培养基还测量了36个不含细胞的空白孔。在培养基中测量的S/B比值低于PBS+，尤其是在培养基中添加FBS或酚红的情况下。可以看出，在添加FBS和/或酚红的细胞培养基中进行测量时，底读的S/B优于顶读。

图3：底读的S/B比值相较于顶读有所提高。

使用BMG LABTECH酶标仪时，只需在控制软件中点击一下，即可在顶读和底读之间进行切换，无需对硬件进行移位。

改用波长范围更大的荧光团

除了外部来源的自发荧光，还需要考虑细胞内成分在激发时可能产生的非特异信号。由于细胞中含有各种蛋白质，包括芳香族氨基酸和其他天然成分，在特定波长的激发下，本身可能会产生自发荧光信号（图4）。因此，即使减少上清液中来自培养基的背景荧光，细胞本身仍然是自发荧光的重要来源。从下图中不难看出，细胞成分在600nm以下的蓝绿发射范围内干扰最大。

图4：导致细胞自发荧光的细胞内成分的荧光发射光谱。

避免细胞自发荧光的一种方法是使用红移荧光团，这种荧光团在较高的波长处发射，可以避开蓝绿区域。当然，红移染料仅限于在特定的检测试剂盒中或作为共轭染料使用。随着红移染料的种类越来越多，在CBA中的使用也更加普及。

图5显示的是同时表达红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）的HeLa细胞的数据，使用96孔板，每样品孔50000个细胞，10个重复，36个无细胞空白孔。培养一夜，使细胞贴壁并分布在孔底，吸去培养基，换为PBS+。使用底读法在相同样品上依次测量激发波长482nm和发射波长530nm的GFP信号强度，以及激发波长 580nm和发射波长620nm的 RFP 信号强度。在表达水平相当的情况下，RFP评估的S/B值是GFP的5倍。