在毒液中筛选新型抗生素以对抗金黄色葡萄球菌

蛇毒分馏物是开发新型抗生素以对抗金黄色葡萄球菌耐药性的有前景来源。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种革兰氏阳性球形细菌。它是一种广泛存在的病原体，因其对多种抗生素产生耐药性的能力而闻名【1】。为应对耐药性问题，迫切需要开发新型抗生素，这促使科学家们在未被探索的领域寻找新的潜在候选物。毒液中含有抗菌肽（AMPs），这些肽类成为新型抗生素的开发开发极具有吸引力的候选分子【2】。

本研究采用高通量筛选方法，通过雷扎红（resazurin）检测法，对黑颈眼镜蛇（Naja nigricollis）、南铜头蛇亚种（Agkistrodon controtrix pictigaster）、捕鸟蛛属（Poecilotheria）和宽螯蝎（Pandinus cavimanus）等动物的毒液组分，筛查其对金黄色葡萄球菌的潜在细胞毒作用。

雷扎红是一种细胞活性检测试剂，具有荧光与比色双重检测功能。其为一种氧化还原（REDOX）指示剂，可广泛应用于细胞活力评估相关的实验中【3】。细菌的代谢活性可将雷扎红不可逆地还原为粉红色、具有荧光的雷扎夫林（resorufin）（见图1）。因此，可通过测定细菌的代谢活性，间接用于毒液组分中新型抗生素的筛选。

图1. 雷扎红检测法的实验原理

为确定雷扎红与菌液的最佳浓度，金黄色葡萄球菌以每孔 1.25 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个细胞的密度接种。雷扎红母液用无菌蒸馏水稀释后加入孔中，最终浓度在 0.125 mM 至 4 mM 之间。随后在 120 分钟内读取雷扎红的转化率。

为验证该方法适用于高通量筛选（HTS），计算了Z'因子。每孔含有 2.5 × 10⁶ 个菌体，培养液为 LB 培养基。阳性对照中添加了 158 μg/mL 链霉素，阴性对照为仅含 LB 培养基的孔。37°C孵育1小时后，加入雷扎红至最终浓度 0.125 mM，并在 120 分钟内读取转化率。

毒液组分用 90 µL 无菌蒸馏水重溶，每种毒液组分设置三重复，每孔加入 30 µL（每次处理剂量为 2 µg），与 2.5 × 10⁶ 个细胞共同孵育2小时，随后加入雷扎红，并使用 FLUOstar Omega 设备每30分钟读取荧光信号，以筛选潜在新型抗生素。具体检测参数如下：

通过预实验确定，最佳筛选条件为每孔使用 0.125 mM 的雷扎红与 2.5 × 10⁶ 个金黄色葡萄球菌细胞，如图2中绿色框所示。

图2. 雷扎红检测法的预实验结果，用于确定高通量筛选的最优条件

利用上述最佳条件（0.125 mM雷扎红，2.5 × 10⁶菌体/孔）对检测方法进行验证，并以阳性对照（158 µg/mL链霉素）与阴性对照（无毒性处理）计算 Z' 因子。结果 Z' 值为 0.7，表明该方法非常适合用于毒液中潜在新型抗生素的高通量筛选。

图3. 雷扎红检测法的Z'因子验证结果。阳性对照（蓝色）为添加158 µg/mL 链霉素，阴性对照为未加入毒性物质的金黄色葡萄球菌。

通过 T-VDAmicrobe array 中92个毒液组分的高通量筛选，分析金黄色葡萄球菌在处理后雷扎红的荧光变化，发现宽螯蝎（Pandinus cavimanus）中的第11号和第24号组分为潜在的新型抗生素候选物（见图4）。

图4. 针对金黄色葡萄球菌的92种毒液组分的高通量抗菌活性筛选结果。

本研究优化并验证了基于雷扎红法的毒液抗菌活性高通量筛选流程。通过Z’值的评估，该方法被证明非常适合筛选具有抗金黄色葡萄球菌潜力的新型抗生素。在使用FLUOstar Omega仪器进行的筛选中，成功在弯螯蝎毒液中发现了两个潜在候选成分。下一步将围绕其剂量反应关系和最小抑菌浓度（MIC）进行进一步验证，以验证其作为新型抗生素的潜力。