利用 CLARIOstar Plus 的增强动态范围功能实现更快速的 PyroGene™ 内毒素检测

凝血因子C（rFC）是一种蛋白酶，其正常功能是在接触脂多糖（如内毒素）时作为鲎凝血级联反应的启动因子2。其天然底物为因子B（Factor B），对其切割位点的研究使得人们得以设计可在体外检测的人工底物。

内毒素与rFC结合后形成活性酶形式。该活性酶可裂解荧光底物，释放可检测的荧光团（图1）。

图1：基于rFC活化的内毒素检测原理；

改编自A.P. Das等人的研究。

典型的 PyroGene™ 检测流程包括两次读数：

• 第一次在反应开始时（t = 0）读取；

• 第二次在 1 小时孵育后读取。

t=0 的读数作为基线，从孵育后的读数中减去即可得到最终信号。

本研究旨在利用 CLARIOstar Plus 的 EDR 功能，探索在更短时间内区分不同浓度内毒素的可行性。

实验中，我们每 5 分钟读取一次荧光信号，持续 1 小时。

结果如图2所示：高浓度内毒素在短至 10 分钟内即可观察到显著的荧光增强。EDR 功能使得单次实验可检测极宽范围的荧光强度。

图2：高浓度内毒素PyroGene荧光检测动力学曲线。荧光强度几乎立即上升。

然而，在常规坐标尺度下，低浓度样品的细微变化可能被掩盖。

图3 显示了在低浓度内毒素条件下，PyroGene™ 检测信号的变化情况。即便在早期时间点，也能观察到明显的荧光上升。

图3：低浓度内毒素PyroGene荧光检测动力学曲线。

为预测未知样品的浓度，PyroGene™ 检测结果通常采用对数–对数（log-log）变换进行线性拟合。

图4 展示了在 15、20 和 60 分钟时的典型结果。
所有时间点的拟合均表现出极高的线性相关性（R² = 1）。

图4：15分钟（蓝）、20分钟（绿）和60分钟（红）采集数据的双对数转换图。所有时间点转换后的数据均呈现良好线性拟合。

接下来，我们评估了该检测在早期时间点的重复性。为此，实验重复进行 4 次，所得变异系数（%CV）结果见表1。

在 15 和 20 分钟时的 %CV 与 60 分钟时相当，且均符合 LONZA 对该检测方法的精度规范。

表1： PyroGene™ 检测重复性比较。4 次重复实验的 %CV 结果显示，检测在最短 15 分钟时已表现出可接受的精度。