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长文丨如何选择蛋白质测定方法

进科驰安

2024-04-02

导读：提到蛋白质测定，研究人员首先想到的可能是Bradford法、Lowry法和BCA法。

提到蛋白质测定，研究人员首先想到的可能是Bradford法、Lowry法和BCA法。其实蛋白质测定方法还有很多，不仅可以对蛋白质定量，还可以细化蛋白质的特征。在本文中，我们将对几种常用蛋白质测定法进行介绍和对比。

什么是蛋白质？

首先我们来简单复习一下什么是蛋白质。除碳水化合物、脂类和核酸外，蛋白质也是构成生命体的主要大分子之一。蛋白质分子是由氨基酸通过肽键连接而组成的复杂聚合物（图1）。有20种氨基酸可作为蛋白质各个亚基的残基，这些氨基酸残基的组合决定了每种蛋白质的独特序列和三维结构，后者最终决定了蛋白质在生物体细胞和组织中的特殊功能。蛋白质在人体内发挥着至关重要的作用，参与细胞内几乎所有的过程。酶大多为蛋白质，是负责催化生化反应的特殊亚类，对新陈代谢至关重要。还有一些蛋白质参与信号转导，如受体和信号蛋白。

图1：由氨基酸结构单元组成的蛋白质骨架结构，氮和氧分别来自氨基（蓝色）和羧基（红色）。侧链基团（绿色）决定了氨基酸性质的不同。

对蛋白质定量的目的是什么？

在生命科学实验室中，需要量化蛋白质的原因多种多样。对蛋白质定量主要是为了对不同的蛋白质样品进行归一化处理，以便后续应用。样品含有蛋白质混合物，是培养细胞、细胞隔室或组织的裂解物。根据蛋白质测定结果，将样品的蛋白质浓度调整一致，并通过Western blotting或免疫沉淀等方法进行比较。为了判定蛋白质纯化或生物技术合成蛋白质的产量时，也需要对蛋白质进行定量。无论是哪种应用，通常都需要分析多种样品，所以有必要建立基于微孔板的蛋白质测定法，与比色皿法相比，其优势在于支持的样品量更大，测定体积更小，通量更高。

测定蛋白质浓度有哪些方法？

有多种检测方法可以量化样品中的蛋白质含量，其灵敏度、原理和检测方式各不相同。以下是几种最常见的蛋白质测定方法，按其检测方式进行分类。

直接测定法：

A280nm

直接测定蛋白质的方法是测量样品在280nm波长处的吸光度。其原理是蛋白质中的色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸残基会在280nm波长处吸收紫外线。由于这几种氨基酸的吸光度很高，因此无需再向样品中添加其他试剂，从而可以在根据现有氨基酸进行定量分析后重新使用提取物。不过，该方法需要量化蛋白质或蛋白质混合物的精确消光系数。消光系数取决于所含氨基酸的芳香残基量，是根据吸光度值计算蛋白质浓度所不可或缺的。A280法比较适用于高浓度样品。点击文末阅读原文，可查阅我们的相关应用说明（AN299：使用BMG LABTECH仪器进行基于吸光度的蛋白质定量方法）。

图2：在低容量兼容板（LVis板，BMG LABTECH）中测量水（蓝线）和2µl BSA蛋白溶液（2mg/ml；红线）的吸光度。

比色法：

Bradford法

除了根据蛋白质中氨基酸的吸光度进行蛋白质定量外，比色法也是常用的方法。Bradford法的原理是考马斯亮蓝R-250与蛋白质结合，过程中最大吸收波长从465nm转变到595nm（图3）。为进行测定，要将含蛋白质样品与Bradford试剂混合，5分钟后记录595nm波长处的吸光度。在测定未知样品的同时，还要建立已知浓度的标准曲线作为参考，为计算未知样品的浓度提供依据。

图3：用于Bradford测定法的考马斯亮蓝未结合（红线）和结合后（绿线）光谱。结合后，染料的最大吸收峰从465nm变为595nm。

在Bradford测定法中，通常使用牛血清白蛋白（BSA）标准溶液计算未知样品的蛋白质含量。不过，选择与样品蛋白质更加接近的参考标准更有可能提高蛋白质浓度测量的准确性。例如根据抗体分泌情况进行克隆筛选时，在Bradford法中使用IgG抗体标准品将比其他蛋白质标准品取得的结果更好。

与其他蛋白质测定方法相比，Bradford法的优点是不易受各种非蛋白质污染物（如盐、溶剂、硫醇或任何还原性物质）的干扰。

比色法：

BCA（二喹啉甲酸）法

BCA法利用的原理是蛋白质中的肽键可将Cu(II)还原成Cu⁺，然后BCA与Cu⁺螯合，螯合物会吸收562nm波长处的光。BCA法也要建立标准曲线，以便对蛋白质进行定量。随着显色产物的形成，可探测到的荧光信号逐渐减弱，因此也可以在荧光模式下进行测定（图4）。

图4：BCA法荧光探测的Epi-absorbance原理。白色板具有特征性的荧光激发/发射波长。由于显色产物具有吸收光的能力，可利用该原理进行比色测定，将颜色变化量与检测到的荧光信号强度相关联。

比色法：

Lowry法

与BCA法相同的是，Lowry法的原理也是基于蛋白质的还原能力。同样，硫酸铜中的Cu(II)被还原成Cu⁺，与Folin-Ciocalteu试剂反应生成蓝色复合物，可在500nm到800nm之间进行吸光度测定。与Bradford和BCA法一样，也需要制出标准曲线，并以此为参考，来计算样品的蛋白质浓度。

荧光法

NanoOrange® 蛋白质定量法采用一种部花青素染料，遇到去污剂包裹的蛋白质，荧光强度会急剧增加。与比色法相比，荧光法测定蛋白质含量的灵敏度更高。该染料与蛋白质作用后，可以被蓝色的光（485nm附近）激发，发出黄色/橙色的光，因此而得名。蛋白质浓度的计算同样基于蛋白质标准曲线。

荧光蛋白检测试剂盒Quant iT® Protein和Qubit® Protein都与NanoOrange® （均为ThermoFisher Scientific出品）的原理非常相似。但使用Qubit® 蛋白质检测试剂盒进行定量，只需三个标准液。配合手持仪器，直接对检测管中的样品进行测量和分析。不过，Qubit® 荧光检测试剂盒也可以用于微孔板读板测定。

蛋白质测定法总结

我们对这几种蛋白质测定方法进行比较，在下表中列出了各自的优缺点。

表1：不同蛋白质测定方法的比较

*浓度范围取自供应商的数据表

分析法	优缺点
A280nm	高变异性；取决于蛋白质的氨基酸组成；需要精确的消光系数；比较快
Bradford	取决于蛋白质的氨基酸组成；比较快
BCA	取决于蛋白质的氨基酸组成；比较快
Lowry	不取决于氨基酸的组成；比较费时
Qubit	可用手持仪器对样品进行连续测量

酶标仪的作用

酶标仪是高效的蛋白质分析工具。根据所需的检测模式，SPECTROstar Nano、Omega系列、VANTAstar®、CLARIOstar Plus和PHERAstar FSX（图5）适用于上述测定方法。除蛋白质定量外，酶标仪还可用于其他类型的蛋白质检测，例如使用极少量的样品研究蛋白质功能和相互作用。PHERAstar® FSX、CLARIOstar Plus、Omega系列和 VANTAstar®多功能酶标仪将不同的检测模式集成在一个设备中，可以对各种蛋白质分析进行多重测定，有助于一次解决多种问题。BMG LABTECH酶标仪还具有超快信号检测和自动移液等专用功能，可用于更细致、更灵敏地分析蛋白质相互作用。

图5：BMG LABTECH酶标仪：从上到下依次为单功能酶标仪SPECTROstar Nano、多功能酶标仪VANTAstar、FLUOStar Omega、CLARIOstar Plus和PHERAstar FSX。

蛋白质相互作用失调通常与紊乱和疾病相关，高级的检测技术在鉴定新药物和治疗方案的高通量筛选中尤为重要。同时双发射功能可在FRET/TR-FRET和FP检测中的相同激发事件下检测两个发射波长，从而节省时间、降低数据变异性，并提高数据质量。特别是在TR-FRET和AlphaScreen应用中，BMG LABTECH酶标仪可利用337nm和680nm的专用激光器大幅提高灵敏度。

转载自：BMG LABTECH