使用TR-FRET结合分析研究分子内双价“分子胶”

靶向蛋白质降解（TPD）是通过诱导E3泛素连接酶和靶向蛋白质的接近来完成的，以促进靶向泛素化和随后的蛋白酶体降解。TPD是一种新兴的治疗工具，在处理致病蛋白方面具有巨大潜力。过去，TPD是通过两种方式实现的：一是使用蛋白质降解-靶向嵌合体（PROTACs），即由两个独立部分组成的双功能化合物，分别与靶点和E3连接酶结合；二是使用单价结合连接酶或靶点的分子胶。

在今天的文章中，我们重点介绍一种名为分子内双价粘合剂（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的新型BRD4双功能降解剂的作用机制，它为靶向蛋白质降解引入了新的模式。不同于PROTACs以trans构象连接目标蛋白和E3连接酶，IBGs以cis构象同时作用并连接目标蛋白的两个相邻结构域，从而增强与E3连接酶的表面互补性。这种构象变化利用目标蛋白与连接酶的天然亲和力，将BRD4“粘”在E3连接酶DCAF16上，从而降解BRD4，而如果没有这种化合物，则不会发生这种降解。通过对BRD4–IBG1–DCAF16三元复合物的结构解析，进一步指导了更高效降解剂的理性设计，使其效力达到低皮摩尔级别。

通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）形成分析法评估BRD4和DCAF16的三元复合物形成。该分析法使用针对BRD4的铕标记抗体和Cy5标记的DCAF16。如果IBG分子诱导标记的BRD4和DCAF16分子之间形成三元复合物，则荧光团之间的距离足够近，可以形成荧光共振能量转移（FRET）对。因此，激发铕供体荧光团将导致能量转移，而Cy5受体荧光可以用酶标仪测量。

图1：TR-FRET分子胶结合分析原理示意图。

在TR-FRET分析中，Cy5标记的DCAF16、His-BRD4和抗His铕标记供体的储备溶液均配制于TR-FRET缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.5，100 mM NaCl，1 mM TCEP，0.05% Tween-20）。开展了两类TR-FRET实验：（1）将IBGs梯度滴定加入BRD4与Cy5-DCAF16混合物（复合物形成分析）；（2）将Cy5-DCAF16滴定加入BRD4或BRD4+IBG中（复合物稳定性分析）。

在前者实验中，IBGs以1:4比例梯度稀释，加入至100 nM BRD4与100 nM Cy5-DCAF16混合液中，装入白色384孔板中，每孔体积为16 μL。在复合物稳定性实验中，Cy5-DCAF16同样以1:4比例稀释加入。最终BRD4构建体浓度为200 nM，IBG1浓度为1 μM。无论哪种实验格式，铕标记抗His抗体和DMSO浓度分别保持恒定在2 nM和0.5%。反应板以50g离心1分钟后覆盖静置于室温30分钟，随后使用PHERAstar FS读板仪读取结果。

本研究的首要目标是体外表征DCAF16、BRD4与双价分子胶IBG1之间可能的相互作用。通过等温滴定量热法（ITC，数据未展示），观察到IBG1、DCAF16与BRD4Tandem（包含BD1和BD2两个溴结构域并由天然连接肽连接）形成三元复合物。同样，TR-FRET复合物形成分析表明，在IBG1滴定条件下，BRD4Tandem与DCAF16之间以剂量依赖的方式形成三元复合物（EC50 = 44 nM；见图2a）。总体来看，IBG1的活性强于其单价前体JQ1。

补充的TR-FRET稳定性分析进一步证实，在IBG1存在时，滴定DCAF16至BRD4Tandem时存在复合物形成（Kd = 712 nM；见图2b）。令人意外的是，即使在不添加IBG1的情况下，也检测到DCAF16与BRD4Tandem存在内在亲和力（Kd = 1 μM），但这种亲和力在孤立的BRD4BD1或BD4BD2结构域中未观察到，说明两者需协同作用才能形成复合物。

通过ITC对比分析表明，在IBG1存在下，DCAF16与BRD4Tandem之间的亲和力增强（Kd由4 μM降低至0.6 μM），同时相互作用的热力学特性也发生改变。

图2：A）TR-FRET三元复合物形成分析：Eu标记抗His抗体与BRD4Tandem结合后，加入等摩尔Cy5-DCAF16及不同浓度的IBG1或JQ1。结果以n=3次重复的平均±标准差表示。B）TR-FRET复合物稳定性分析：His标记的BRD4Tandem或BRD4BD1（200 nM）与Eu抗His抗体结合后，加入不同浓度的Cy5-DCAF16，并比较1 μM IBG1存在与否的效果。n=2次独立实验，技术重复2次。

在确认IBG1的作用机制后，研究人员合成了新的化合物，以增强其对BRD4和DCAF16的分子胶合活性。新化合物IBG3在降解BRD4方面优于IBG1，其降解效率达到低皮摩尔水平（DC50 = 6.7 pM，数据未公开）。TR-FRET实验中，IBG3对BRD4–DCAF16复合体的“粘合”能力也有所提升（EC50 = 32 nM；见图3）。

图3：TR-FRET三元复合物形成测定。将抗组蛋白结合到BRD4Tandem的抗组蛋白与等摩尔Cy5标记的DCAF16以及浓度不断增加的IBG1、IBG3或JQ1混合。平均值±标准差，n=3。

与其前体化合物类似，IBG3相较于BRD3显示出对BRD2和BRD4更高的特异性，更倾向于作用于串联溴结构域而非孤立结构域，并且其机制仍由DCAF16介导，表明其仍通过同样的分子内“胶合作用”实现降解。

图4：PHERAstar FSX酶标仪。