如何获得更好的数据？一文了解5个酶标仪使用贴士- 大数跨境

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如何获得更好的数据？一文了解5个酶标仪使用贴士

进科驰安

2024-01-10

导读：在生命科学研究领域，酶标仪是一种应用广泛的实验室仪器，可测量化学、生物或物理过程。通过将光信号（吸光度、荧光

在生命科学研究领域，酶标仪是一种应用广泛的实验室仪器，可测量化学、生物或物理过程。通过将光信号（吸光度、荧光或化学发光）转化为读数，酶标仪支持研究人员进行多种生物学分析。

从实验室的基础研究到药物发现和开发，再到诊断等应用，酶标仪具有强大的检测能力。

那么如何让您的酶标仪发挥最佳性能，获得可靠、准确的数据呢？以下为您放送5个小贴士。

优化增益设置

酶标仪的测量范围指的是可测量的最强和最弱信号之间的范围，“增益”是影响此范围的主要参数。高增益可大幅放大光信号，适用于产生信号较弱的样品。低增益对信号的放大程度较小，适用于产生信号较强的样品。增益设定取决于具体的检测方法。增益设置过高可能会导致读数饱和并失去准确性；增益设置过低可能导致低水平信号检测效果不佳（图1）。要找到理想的增益值，没有放之四海而皆准的答案，但可以遵循一些通用准则：

避免信号饱和

避免使信号强度超过酶标仪的动态范围。如果出现过饱和，会导致超出范围的信号被剪切，或导致额外信号损失。

优化信噪比

选择的增益值应最大程度地增强信号，并降低背景噪音。过高的增益会放大信号，同时也可能放大噪音。找到合适的平衡点至关重要，这将有助于优化信噪比。

使用校准和标准曲线

使用一系列已知浓度的样品建立标准曲线，可以得出需要测量可靠信号的浓度范围，有助于确定仪器所需的最佳增益设置。

保持一致性

一旦找到能够提供可靠、一致结果的增益值，应尽量在相关实验中使用相同的设置，这将有助于确保结果的可再现性。

遵循制造商的建议

酶标仪制造商会为具体的测定或分析法的提供相应的指导建议，该资料是增益调节的实用参考。

对于BMG LABTECH酶标仪的建议是，增益调节初始设置的目标值为样品孔预计产生最强信号的90%。在动力学测定等应用中，信号随时间而变化，则建议初始将目标值设定为空白样品的10%。另外，比较先进的酶标仪具有自动增益调节功能。CLARIOstar® Plus和VANTAstar® 配备的动态范围扩展技术 (EDR) 可提供8个数量级浓度的动态范围，无需手动调节增益。

图1：某酶标仪的动态范围

注意闪光次数的影响

荧光或吸光度测量数据的可靠性和准确性与激发样品的闪光次数有关，需要了解闪光次数对测量产生的影响（图2）。

图2：用于荧光检测的光源和探测系统

一个关键点是闪光次数与测量时间之间的权衡。酶标仪进行测量所需的时间会随着闪光次数的增加而增加。对于动力学应用，测量数据点之间的时间间隔极短，多次闪光会显著增加测量时间。

当应用对速度有要求时，容易倾向于选择较少的闪光次数。但酶标仪可以得出多个数据点的平均值。使用的闪光次数越多，每次闪光之间的差异就越小。

虽然较多的闪光次数有助于提高测量的统计可靠性，但不建议每次测量都使用尽可能多的闪光次数，这样会增加测量时间，而且与使用较少闪光次数的测量相比，并不一定能明显改善数据质量。对于多数检测应用，10-50次闪光是够用的。某些特定的应用可能需要更多的闪光次数。

总之，为一项检测选择适当的闪光次数，有助于保持较低的变异系数 (%CV) 和标准差，从而确保数据的可靠性和准确性。

找到理想的焦距

焦距是指酶标仪的探测系统与微孔板中样品之间的距离。最佳对焦位置是酶标仪能检测到样品最高信号强度的平面。

了解样品的性质

不同的样品需要不同的焦距来获取样品的最佳信号强度。例如，贴壁细胞样品会在微孔板的孔底形成细胞层，接近孔底部的焦距可获得最高的信号强度。先进的酶标仪可在测量前进行焦距调整，自动识别某个样品或某组样品的最佳焦距（图3）。

图3：某酶标仪的焦距曲线

了解微孔板类型

如果使用的微孔板类型不同，同一样品的最佳焦距也会有所不同。比如孔底分不同形状，如果是圆形的，孔内每个位置的液体深度和局部环境都略有不同。因此，相同的样品在不同形状的微孔板中可能会产生不同的焦距。不同材料或不同孔密度（如96/384/1536）的微孔板也可能需要不同的焦距高度。微孔板底座的高低也会有影响。

注意加液体积的影响

样品的加液体积会影响焦距，在操作中应确保一致性。如果加液体积出现差异，无论是无意为之还是出于其他原因，都会影响结果的可靠性。各孔之间就算相差几微升，也会使测量结果出现较大偏差。

降低自发荧光

基于细胞的分析法（CBA）是生命科学研究不可或缺的工具。在这方面通常会遇到的一个挑战是自发荧光，即生物物质自然发出的荧光。自发荧光通常来自细胞培养基或细胞本身的成分。

生化检测通常在纯水或成分简单的缓冲溶液中进行，自发荧光可以忽略不计。但CBA通常需要额外的生物成分，如血清或氨基酸，来为细胞提供营养。这些额外成分会增加自发荧光。细胞也会因其成分而产生自发荧光。细胞中天然存在的荧光团通常会在光谱的蓝绿区发出荧光，在考虑规避其自发荧光特性的解决方案时需要考虑到这一点（图 4）。

图4：导致细胞自发荧光的细胞内成分的荧光发射光谱。

那么，在酶标仪上进行CBA检测时，应采取哪些措施才能获得可靠、准确的数据呢？

缓冲液的选择

建议选择自发荧光较低的缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水 (PBS)，可大程度提高信噪比。应尽量避免在培养基中使用酚红等分子，并尽可能减少血清等补充营养物的用量。对于荧光测量，可考虑使用FluoroBrite™ 等培养基，其自发荧光水平较低，是PBS的良好替代品。

光学元件的选择

如果可选，建议使用底部光学元件进行CBA的测量。这样可以避免光线穿过细胞上方的上清液。如果研究的是贴壁细胞，底部光学元件可确保样品发出更好的信号，并减少悬浮细胞的培养基可能产生的自发荧光。

荧光团的选择

如果可选，应使用红移染料进行检测，以避免细胞成分产生自发荧光。红移染料在波长较大的区域发射，可避免探测到蓝绿区域。天然细胞荧光团的自发荧光通常会在蓝绿区域产生干扰，在光谱的红色区域进行测量有助于减少这些天然荧光团产生的背景荧光。

降低异质样品的数据变异性

在使用酶标仪进行测量时，降低不必要的数据变异性非常重要。在CBA应用中，细胞通常以非均质的方式生长。这对数据的准确性和可靠性带来了挑战。有些酶标仪只从孔的中心读取一个读数，由于细胞在整个孔中分布不均匀，这个读数可能无法反映样品的全貌。在这种情况下，建议在多点采集信号，以降低数据变异性。以螺旋、轨道或矩阵模式捕获信号的酶标仪可确保更精确的测量（图5）。这不仅适用于贴壁细胞等非均质样品，也适用于聚集的细菌和酵母。