使用结晶紫生物膜定量检测法测试新型噬菌体的抗菌特性- 大数跨境

进科驰安

2025-11-25

大肠杆菌是人类和动物肠道中常见的细菌，通常有助于维持健康的微生物群落。然而，一些大肠杆菌菌株具有致病性，可引发严重疾病，如泌尿道感染、腹泻、脑膜炎和败血症。致病性大肠杆菌对现有常用抗生素的耐药性日益增强。因此，迫切需要研发具有抗菌特性的全新药物，或寻找替代方式来对抗这些感染。

噬菌体疗法（phage therapy）是传统抗生素的理想替代方案。噬菌体作为具有抗菌特性的病毒，能特异性感染细菌（导致细菌细胞溶解），且对人类或动物无任何不良影响。

在本研究中，研究人员从医院废水中分离并鉴定出一种新型噬菌体（APTC-EC-2A）。该噬菌体对多株抗生素耐药的大肠杆菌表现出良好的抗菌活性。

然而，大肠杆菌（以及许多其他细菌）能够形成生物膜，而生物膜通常比浮游细菌更具耐药性。为评估APTC-EC-2A对细菌生物膜的抗菌特性，研究中采用了结晶紫生物膜质量定量法以及活/死菌活性检测法。

结晶紫生物膜检测法

结晶紫生物膜检测法最早在30多年前发展应用起来，并在此后不断经过改进。其核心步骤为：在96孔板底部培养细菌生物膜，并分别加入不同浓度的噬菌体（或其他抗菌剂）进行处理。随后，残留的黏附生物膜用结晶紫染色，未结合的染料洗去，再向孔内加入30%醋酸溶解结合的染料。通过测定上清液在595nm的吸光值，可以推算出生物膜的质量（图 1）。

图 1：抗菌特性检测的原理示意图。

噬菌体效应测试

简要流程如下：

将1McFarland单位的E. coli XL10生理盐水悬液以1:15稀释到LB培养基中。

在96孔板中，一列6个孔仅加入LB培养基作为阴性对照，其余孔加入150µL细菌悬液。

37°C培养48小时以促进生物膜形成，随后用无菌1×PBS清洗两次。

每孔加入200µL噬菌体溶液（浓度为5×10⁸pfu/mL或5×10⁹pfu/mL），LB培养基单独作为阴性对照，LB+细菌悬液作为阳性对照。

37 °C再培养24小时。

噬菌体处理后，孔内用无菌PBS清洗，去除浮游菌。

每孔加入0.1%结晶紫200µL染色15分钟，用蒸馏水冲洗并过夜风干。

每孔加入30%醋酸溶解染料，并测定595nm的吸光度。相对生物膜量通过与阳性对照吸光度比较获得。

同样的方法用于测试耐药性的大肠杆菌菌株 ED、PC 和 378大肠杆菌菌株。

新型噬菌体降低生物膜生物量

结果显示，所测试的噬菌体具有显著的抗生物膜特性，且随剂量增加，生物膜生物量呈剂量依赖性下降。

当 APTC-EC-2A 终浓度为1×10⁹ pfu时，明显降低了XL10 Gold、ED、PC和378菌株的生物膜质量，相比未处理对照具有统计学显著差异（图 2）。

当终浓度为1×10⁸pfu时，生物膜质量最高下降53%（范围 16–54%）。
当终浓度为1×10⁹pfu时，生物膜质量最高下降70%（范围 27–70%）。

图 2：结晶紫生物膜检测结果。测定 E. coli 不同菌株的生物膜质量（OD 595），与未处理对照比较，验证噬菌体的抗菌特性。

采用LIVE/DEAD BacLight细菌存活性试剂盒来确定APTC-EC-2A噬菌体处理后E. coli细胞中存活（SYTO9，绿色）与死亡（PI，红色）细胞的百分比。在APTC-EC-2A处理的生物膜中，E. coli XL10、ED和PC的死亡细胞百分比在两种噬菌体浓度下均较未处理对照有统计学显著增加。然而，对于E. coli 378，仅在最高浓度的APTC-EC-2A处理下才观察到与对照相比显著增加的细胞死亡率和抗菌特性（图 3）。

图 3：活/死菌检测结果。通过共聚焦激光显微镜计数XL10 Gold（A）、ED（B）、PC（C）及378（D）菌株培养物中的死亡细胞百分比，评估抗菌特性。

结论

本研究发现了一种对耐药性大肠杆菌具有抗菌活性的新型噬菌体。其广谱溶解活性及在宽pH值和温度范围内的稳定性，使其成为推进临床前及临床开发的有前景候选物。

BMG LABTECH系列酶标仪多年来广泛应用于细菌生长检测。该设备可实现生长动力学曲线测定，并能根据需求提供培养功能及长期高强度振荡。所有仪器均配备固态CCD分光计，可进行220-1000nm波段的吸光度测量，使其成为测定抗菌药物及其他药物的理想平台。

References

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Staneva, A.D., et al. Antibiofouling Activity of Graphene Materials and Graphene-Based Antimicrobial Coatings. Microorganisms 2021, 9, 1839.
Stepanovic, S., et al. A modified microtiter-13 plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J Microbiol Methods, 40 14 (2000) 175.

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