分子胶：靶向蛋白降解新星

分子胶是促进靶向蛋白质与细胞降解机制相互作⽤的小分子。通过诱导目标蛋白质与泛素连接酶接近，确保目标蛋白被泛素-蛋白酶体系统顺利降解（图1）。

图1：泛素-蛋白酶体途径。改编自Zhao et al.

分子胶降解剂能够影响蛋⽩质之间的相互作⽤，为消灭致病蛋⽩开辟了新的治疗策略，已成为研究的热点。从理论上讲，这类技术的潜力是巨大的，为治疗癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病的小分子药物开发提供了新的途径。

传统的药物开发通常侧重于寻找适合蛋白质活性位点的小分子。约有85%不可成药蛋白质缺乏传统的药物结合位点，或进入这些位点受到阻碍，而分子胶的出现为打破这些限制提供了机会。

与占位驱动型抑制剂相比，分子胶还有其他潜在优势，如药效更持久、毒性更小、药效更高且不易引发耐药性。

分子胶和靶向蛋白降解嵌合体（PROteolysis TArgeting Chimeras, PROTACs）都是靶向蛋白质降解剂。PROTACs也是诱导泛素-蛋白酶体系统对目标蛋白质的降解。PROTAC由两个独立的分子组成，通过连接分子结合在一起，形成一个双功能分子，两端分别与目标蛋白和E3泛素连接酶结合（图2）。而分子胶结构更为简单，与连接酶（最常见）或目标蛋白相互作⽤。由于没有连接分子，分子胶的分子量较小，因此与PROTACs相比，分子胶有更好的细胞渗透性和生物利用率。

图2：分子胶和PROTAC的功能示意图。(a) PROTAC同时与目标蛋白和E3泛素连接酶结合。(b) 分子胶通过与E3泛素连接酶（图中所示）或目标蛋白结合，诱导目标蛋白与E3泛素连接酶之间的相互作⽤。在这两种情况下，靶向蛋白质都会被多泛素化并降解。

沙利度胺、来那度胺和泊马度胺（免疫调节剂，IMiD）都属于诱导靶向蛋白质降解的分子胶药物。这几种降解剂都是将目标蛋白质与cereblon接近，后者是目前应用最广的E3泛素连接酶。 

还有一些分子胶也在临床开发中。CC-220、CC-92480和CC-90009正处于II期试验阶段，用于治疗不同的适应症，包括系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤和急性髓性白血病。

同时，分子胶领域的新发现促使人们对这种解剂技术的关注日益高涨。迄今为止，大多数分子胶是偶然发现的。PROTACs的发展是由连接分子和“弹头”的设计原理推动的，但有效胶的分子特征在很大程度上仍是未知。对分子胶工作原理的不断了解，将促进合理设计的可行性。

大多数分子胶是在一个接触点上与连接酶（最常见）或目标蛋白结合。近期有一类新的分子胶被发现，这种降解剂可在两处与目标蛋白结合。通过对目标蛋白质、降解剂和连接酶形成的三元复合物的研究，指导低皮摩尔效力的改良降解剂的合理设计。

英国邓迪大学和奥地利科学院CeMM分子医学研究中心的研究人员在《Nature》上发表了一项名为“Targeted protein degradation via intramolecular bivalent glue”的研究。

研究的一个关键发现是，降解剂在两个接触点上的结合，使目标蛋白的结构重排。这种重排稳定了目标蛋白与E3连接酶的相互作⽤，对靶向降解至关重要。

在研究中，HiBiT降解测定法用于评估三种不同分子胶降解剂的降解效力和可能的最大降解水平，使用的是Promega的“Nano-Glo® HiBiT裂解检测系统”，分析仪器是BMG LABTECH的PHERAstar® FSX。 研究中使用的降解剂（IBGs 1-3）靶向与癌症和炎症有关的含溴结构域蛋白BRD2和BRD4（图3）。这项研究开辟了一个新的探索领域，即蛋白质降解剂通过顺式桥接蛋白质结构域来增强与E3连接酶的表面互补性，从而实现有效的泛素化和降解。

图3 ：HiBiT降解检测。用分子胶降解剂IBG1、IBG2和IBG3处理HEK293 HiBiT敲入细胞 5小时，通过HiBiT裂解检测系统量化BRD2-、BRD3-和BRD4-HiBiT蛋白的水平。数据、n=3独立实验、平均值+/-S.D. 改编自Hsia et al.

分子胶的合理设计仍处于起步阶段，但对于希望将人工智能指导的方法与已知分子胶结构数据库相结合的前沿企业来说，这显然是一个值得关注的领域。研究重点是进一步了解蛋白降解标签（degrons），即蛋白质上作为泛素连接酶识别信号的序列。

目前使用的许多分子胶标签较大，无法标记编码细胞原生蛋白的基因，或者作用范围太广，超出了目标蛋白的范围。为了打破这种局限，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的研究人员开发了一种名为PACE的持续进化平台，可以生成较小的蛋白降解标签，形成的分子胶复合物具有触发靶向蛋白降解所需的特异性。较小的降解标签通过质粒编辑被导入细胞基因组，并在其中募集泛素连接酶cereblon。PACE平台可用于开发具有新型降解标签的分子胶复合物。

对新泛素连接酶的寻找也在进行中。在目前的分子胶研究领域，cereblon仍是使用最广泛的。目前人体中已知的E3泛素连接酶有600多种。其中一些对特定细胞类型具有特异性，有望成为克服分子胶脱靶效应的重要一步。

大多数分子胶降解剂靶向细胞内蛋白质，但靶向细胞外和膜结合蛋白质的机会也是存在的。我们在这篇文章中探讨了其他新兴降解技术，包括利用溶酶体降解途径的技术。

击破“不可成药”：靶向蛋白降解技术的发展

分子胶有望为癌症、神经退行性疾病和自身免疫性疾病等多种疾病带来新的治疗机会。分子胶药物的潜力与多种疾病相关的非酶蛋白有密切联系，在这方面，传统的小分子抑制剂与活性位点结合已被证明是无效的。像这样的新方法将为未来小分子药物的发现、开发、高通量筛选、临床前测试、临床试验以及最终转化为临床应用带来令人期待的机会。

酶标仪是研究分子胶的多功能工具，可用于评估分子胶介导的蛋白质降解效果。而且分子胶候选物的筛选通常需要高通量检测能力，这正是先进酶标仪的强项。

化学发光及其衍生技术是研究分子胶蛋白-配体结合的有力工具。NanoBRET™和HiBiT技术用于测量活细胞中的结合和泛素化。配备孵育和大气控制功能的酶标仪能够进一步增强这一功能。CLARIOstar® Plus酶标仪可支持长期动力学实验的运行，同时保持细胞的生理环境。图4展示了在CLARIOstar® Plus上使用NanoBRET进行泛素化分析的示例。

图4：NanoBRET™ 泛素化分析结果。

荧光偏振测定法也可用于研究分子胶与其靶蛋白的结合活性以及相互作用的动力学。可以测量荧光标记的分子胶与靶蛋白结合后引起的荧光偏振变化，提供有关靶向蛋白质和降解剂之间的结合强度和相互作用动力学的信息。 

应用说明 “实时监测泛素化：基于荧光偏振的方法UbiReal”介绍了一种荧光偏振方法，可用于实时跟踪泛素连接和解连接的各个阶段。该方法适用于高通量分析，利用荧光偏振技术测量荧光标记的泛素。使用UbiReal可以监测泛素化周期的所有阶段（图5）。点击文末“阅读原文”，可查看详情。

图5：UbiReal检测原理

酶标仪还可用于评估分子胶介导的蛋⽩质降解中涉及的蛋⽩质相互作⽤。AlphaScreen®、时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）等技术或NanoBRET™等化学发光方法，可支持在微孔板中测量靶标与连接酶之间的相互作⽤。

另外，高通量筛选技术可用于优先筛选潜在的分子胶降解剂，而酶标仪是一种可根据筛选需要进行扩展的有用工具。

BMG LABTECH提供一系列涵盖吸收光、荧光和化学发光测量的灵敏检测设备。那么对于与分子胶研究相关的特定需求和应用，哪种酶标仪更适合？

其中PHERAstar FSX专为筛选而设计，在降解剂研究中，是高性能高通量检测的首选酶标仪。

VANTAstar®和CLARIOstar Plus均支持波长扫描，并采用动态范围扩展技术，单次运行即可提供高质量数据。配备线性可变滤光片光栅TM和多种滤光片选择，可提高透光率和灵敏度。对于活细胞检测，还可配备大气控制单元。

BMG LABTECH的酶标仪都具有超快的读取能力。Omega系列、CLARIOstar Plus和PHERAstar FSX酶标仪还配有移液装置，可在移液的同时发挥最优探测能力。

这些多功能酶标仪将高性能、小反应体系、测量时间短等优势相结合，可大大节省试验材料等资源。

转载自：BMG LABTECH