酶标仪上细菌代谢的微生物学应用

在生命科学研究领域，酶标仪是一种应用广泛的实验室仪细菌代谢涵盖了一组复杂且相互关联的化学反应，这些化学反应维系着细菌的生命活动。在微生物学领域，许多应用都依赖于对酶促反应的监测，或对特定代谢物、酶浓度以及生命分子过程中所涉及的化学反应的测量。这些应用在基础研究、环境研究、生物技术的不同领域，甚至是药物开发等方面都具有重要价值。

细胞从环境中提取能量，并通过高度整合的化学反应和相互作用网络将较小的分子转化为细胞成分，这一过程被称为代谢。代谢的基本策略是形成能量和大型分子前体。细菌代谢指的是在这些生物体内发生的复杂反应。

图1：分解代谢和合成代谢反应

细菌种类繁多，并进化出了多种代谢途径，使其能适应各种环境。其中一些细菌可以根据环境条件在不同的代谢途径之间切换，而另一些细菌则高度专一，适应特定且通常要求极为苛刻的环境。

在细菌中，一些常见且重要的代谢途径包括糖酵解（将葡萄糖转化为丙酮酸）、磷酸戊糖途径、三羧酸循环（TCA循环，涉及碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的乙酰辅酶A氧化）、不同类型的发酵、卡尔文循环（光合作用的一部分，从二氧化碳合成葡萄糖），以及固氮作用（将分子态氮转化为氨）（图2）。

 图2：细菌生理的化学反应、代谢过程及代谢途径的简化示意图

 表1：不同类型的微生物及其营养来源

测量细菌代谢可帮助研究人员掌握多种生物过程，并广泛应用于多个领域。它们可以为优化发酵过程提供工业用途，例如用于生产抗生素、酶和燃料的发酵过程。仅抗微生物药物耐药性这一项，就极大地推动了通过了解细菌代谢和细菌生长来开发新型药物的新方法。此外，代谢研究对于药物开发及疾病机制研究也具有重要意义。

研究细菌代谢的方法多种多样，以下是几种常见的实际应用，研究人员可直接使用或加以改进。

每条代谢途径的核心是活性酶及其底物转化，因此，酶活性可作为细菌代谢的良好检测指标。例如，在应用报告《通过荧光检测法监测赖氨酸去乙酰化酶活性》中，研究人员使用CycLex SIRT1试剂盒测定大肠杆菌赖氨酸去乙酰化酶CobB的动力学特性（图3）。

图3：赖氨酸去乙酰化酶活性检测原理示意图

此外，赖氨酸去乙酰化在基因表达调控、蛋白质功能及稳定性控制、以及代谢调节中均发挥重要作用（图4）。

图4：大肠杆菌CobB酶动力学特性测定

细菌代谢的另一个重要因素是氧化还原酶。NADH/NAD+和NADPH/NADP+是代谢过程的许多氧化还原酶使用的辅助因子，能够监测它们的还原情况，从而提供一种可靠的方法来测量它们的活性。在应用说明《ELISA检测和NADH/NADPH转换检测》中，BMG LABTECH检测仪的紫外-可见分光光度计在快速测定氧化和还原烟酰胺辅因子方面的能力得到了强调（图5）。NAD+还原为NADH和NADP+还原为NADPH的过程可在340 nm处进行监测。

图5：NADP⁺/NADPH转换曲线的吸光度测量数据回归拟合曲线。红线是260纳米处的测量值拟合，蓝线是340纳米处的测量值拟合，绿线是340/260纳米处的测量值比值拟合

氧化代谢过程中会产生活性氧（ROS），其测定可提供关于细胞信号转导事件的重要信息。这些事件可能会影响基因表达和酶活性调控，并引发细菌代谢的变化。在应用报告《利用荧光分析检测烟曲霉分离株产生的活性氧》中，研究团队描述了一种可用于细菌活性氧检测的荧光检测方法。

葡萄糖在能量消耗中起着核心作用。葡萄糖还可以通过发酵代谢产生乳酸。因此，葡萄糖和乳酸水平的测量为研究人员提供了特定细菌细胞代谢活动的洞察力。在应用笔记中，葡萄糖测定和乳酸测定可以精确监测细胞葡萄糖代谢，基于化学发光的现有检测方法被成功地小型化，并可在VANTAstar®酶标仪上读取（图6）。VANTAstar酶标仪的动态范围扩展技术使这些检测方法易于操作，从反应开始到化学发光读数，无需人工干预。

图6：乳酸和葡萄糖发光检测原理示意图

支原体是一种不寻常的细菌，因为它没有细胞壁。它们通常是实验室细胞培养中不受欢迎的污染物，科学家需要快速、准确的方法来确保他们的培养物不受污染。应用说明Lonza的MycoAlert检测法在BMG LABTECH酶标仪上的应用描述了一种使用特定于其代谢的酶来探测支原体的检测方法（图7）。

图7：MycoAlert™反应的动力学曲线，其中蓝色代表无支原体的样品，红色代表支原体阳性的样品

氧含量和pH值是细菌代谢的重要参数。它们直接影响代谢途径和特定酶的活性，并可能影响细菌的生长。测量氧含量和pH值有助于研究人员更好地控制细菌过程。开放流动呼吸测定法是一种生理相关方法，可用于测量细胞呼吸。在应用报告《通过实时监测细胞外酸化与耗氧量来测量细胞代谢变化》中，该系统被转换为96孔微孔板格式，从而能够在生理相关大气条件下实时测量氧和pH水平。该系统是在配备有大气控制单元的CLARIOstar®酶标仪上开发的（图8）。该系统在人类细胞中使用时，可以轻松地用于细菌。

图8：在10%氧气环境中的耗氧量。含有HepG2细胞的重复孔用抗霉素A处理

酶标仪具有与细菌代谢研究特别相关的功能。这些功能包括将细菌保持在最佳生长条件下的大气控制单元和振荡选项，以及无需人工干预即可可靠探测各种浓度和信号强度的样本的动态范围扩展技术。

使用96孔、384孔或1536孔微孔板可同时处理多个样品。实时测量适用于绘制细菌代谢中可能发生的动态变化。例如，这适用于细菌生长动力学和酶活性的变化。

酶标仪还能够在各种条件下使用不同的检测模式进行并行测量。因此，多功能酶标仪在细菌代谢的常规和高级测量中具有速度、可再现性和规模方面的优势。

我们对细菌代谢的了解仍在不断增长。因此，随着全球实验室不断涌现新的发现、技术和应用，未来几年对细菌代谢测量的需求将继续增长。酶标仪检测技术的进一步发展和特定检测方法的创新应成为未来发展的强大催化剂。