【多组学】View（IF=9.7） | 蛋白组+代谢组助力大规模肿瘤样本标志物筛查

丰信生命科学

2024-11-15

导读：发表时间：2024年10月发表期刊：View影响因子：9.7合作单位：复旦大学、厦门大学、广西医科大学附属肿瘤医院组学类型：蛋白组学+代谢组学

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关于文章

今天分享这篇文章，来自复旦大学刘晓慧、厦门大学翔安创新实验室熊悦婷和广西医科大学附属肿瘤医院舒宏在 View 期刊（IF=9.7）发表的最新研究成果“The characterization of serum proteomics and metabolomics across the cancer trajectory in chronic hepatitis B-related liver diseases”。该文章基于质谱蛋白组和代谢组发现肝癌发展轨迹中的风险标志物，是刘晓慧和熊悦婷2022年合作发表在 EMBO Molecular Medicine 颅内动脉瘤标志物研究的姊妹篇。这篇文章在蛋白标志物的基础上进一步整合了代谢标志物的验证，与单一组学标志物组合或 AFP 等经典肿瘤生物标志物相比，诊断效果更加全面、准确、特异和灵敏。

总体标志物筛查策略延续采用四步法：

1. 建立疾病特异性的蛋白血清轮廓谱（探索阶段）；

2. 整合实验和文献中多组学数据，构建一个全面的蛋白/代谢候选标志物库；

3. 大规模全局高效筛选，候选蛋白和代谢分子靶向验证（验证阶段）；

4. 机器学习联合蛋白代谢筛查精准诊断标志物panel。

接下来我们具体看下实验方案与研究思路……

主要内容

主题：整合蛋白组+代谢组提高疾病阶段性诊断价值

蛋白组：DIA+PRM+机器学习挖掘质谱血清标志物

代谢组：非靶+靶向+机器学习挖掘质谱血清标志物

刊物：View, 2024, Accepted（IF 9.7）

1. 建立疾病特异性的蛋白血清轮廓谱（探索阶段）

首先，收集样本和蛋白代谢实验设计。文章收集了从感染HBV/HCV到发展为HCC的各个阶段血清样本，共5组，316份样本，分为3个队列：

HBV:乙肝；HCV:丙肝；LC:肝硬化；HCC:肝细胞癌(A/B/C三期)；NC:正常对照

发现队列（Ⅰ）35例：用于DIA非靶蛋白组检测；
验证队列（Ⅱ）246例：用于PRM靶向蛋白组和MRM靶向代谢组检测；
独立验证队列（Ⅲ）35例：用于PRM靶向蛋白组和MRM靶向代谢组检测。

接下来，DIA蛋白组方案：

对于蛋白组研究，首先要制备样本，该研究要对3个队列共316份样本进行蛋白提取和酶解，可想而知是个很大的工程，这里采用专用快速前处理试剂盒，简化了步骤，节省了时间，3步法操作，反应时间仅需2-3小时即可获得洁净肽段用于质谱上机。

对于DIA蛋白组数据分析，采用Spectronaut软件搜库和EasyDIA平台质控以及悟空云平台生信分析的一整套方案，全面提升数据深度、保障大规模结果可性度并可视化蛋白统计与注释。

具体来看，文章通过6例混合血清样本来监测仪器变化，如下图所示，计算了QC样本的皮尔森相关性、肽强度分布和变异系数（CV）以及分析了所有DIA样本的蛋白强度分布。这些内容都可以在EasyDIA平台中实现，来评估数据质量。

结果显示，6例QC样本之间的相关性几乎均在0.95以上，肽强度和蛋白强度分布都均一性良好，中位数CV=0.17，说明仪器系统稳定，数据质量良好。

2. 构建一个全面的蛋白代谢候选标志物库

将每组与对照组进行比较，结果显示，DIA蛋白组共筛选到 199 种蛋白质发生显著变化。

如何建立全面的候选生物标志物库？实验 + 文献，蛋白 + 代谢

纳入DIA蛋白组筛选到的199种五个阶段血清差异蛋白，以及文献调研的肝病每个阶段的候选生物标志物——不同生物标本中与 HCC 相关的 2916 种蛋白质和 103 种代谢物。最终获得3059种蛋白和103种代谢物，需要进一步大规模靶向验证。

3. 大规模全局高效筛选，候选分子靶向验证（验证阶段）

为了完成规模化的3059个靶标蛋白质的验证和确认，需要一个工具：能增加靶向蛋白质组学的覆盖率、节约成本——DeepDIA算法即是为提升DIA数据分析而生。此项工作，使用深度神经网络的原理，用可检测性分数的阈值来筛选肽段。

我们进一步将该方法拓展应用为DeepPRM，使用深度神经网络的原理，帮助预测肽段的可检测性和保留时间，大大提高了PRM的验证效率。

该项目输入3059个蛋白，预测到了4217个候选肽，然后在血清酶解混合物中初步筛选到404个蛋白1038个肽，最后经人工检查后确定了404个高置信度蛋白/肽，用PRM靶向定量验证。

另外103种代谢物的大规模验证。基于DIA和PRM检测到的差异蛋白功能/通路的富集结果，来指导代谢物分析，最终选择胆汁酸及其相关氨基酸共7种代谢物进行靶向定量验证。

4. 机器学习联合蛋白代谢筛查精准诊断标志物panel

标志物筛查目的：区分(i) HCC vs 其他组（LC、HBV和NC合并为对照Ⅰ）；(ii)LC vs 其他组（HCV、HBV和NC合并作为对照Ⅱ）。

通过优化的机器学习策略最终筛选到两种蛋白质组合（P13和P10）、两种代谢物组合（M4和M3）和两种蛋白质-代谢物组合（Com-8和Com-12）。

引人注目地是，与AFP等经典肿瘤标志物相比，该研究筛选到的标志物组合都表现出卓越的准确性、AUC、敏感性和特异性。在区分LC与HBV时，整合的蛋白质-代谢物组合Com-12，比单一蛋白P10/单一代谢M3性能更好，能够密切监测和评估肝病进展。

标志物组合中血清蛋白变化与肝病生理病理学和致癌轨迹非常吻合：如参与血小板脱粒（C1QC、SERPING1、TIMP1、FGG、VWF 和 EFEMP1）、细胞外基质（ECM）（EFEMP1）、炎症（TIMP1）和血管生成（VWF）途径的蛋白质随着肝病的严重程度而逐渐增加，RBP4 和 BTD 的水平从正常到肝病进展持续下降。三种候选代谢物（胆碱、甜菜碱和牛磺酸）先前也与 HCC 有关。

基于机器学习对大规模定量数据进行高性能标志物组合筛选和评价的完整思路，也可以实现：采用多种算法，如支持向量机（SVM）、随机森林、逻辑回归、神经网络以及其他算法模型的比较等，结合ROC曲线和混淆矩阵进行模型性能评估，确立打分最佳的biomarker组合。