【蛋白芯片】Advanced Science（IF：17.521） | 巨噬细胞-乳腺癌：巨噬细胞PYK2，乳腺癌治疗新发现

杂志名称：

Advanced Science（2022 IF 17.521）

文献题目：

Mouse Modeling Dissecting Macrophage–BreastCancer Communication Uncovered Roles of PYK2 in Macrophage Recruitment andBreast Tumorigenesis

第一作者：

Anna-Katharina Müller

通讯作者：

Sima Lev

作者单位：

Molecular Cell Biology Department WeizmannInstitute of Science, Rehovot 76100, Israel

发表时间：

2022年

文献全文下载地址：

https://hal.sorbonne-universite.fr/hal-03549689/document

本实验所用产品：

品名：Human Cytokine Array G5

货号：AAH-CYT-G5（人80个细胞因子抗体芯片）

详情：https://www.raybiotech.com/human-cytokine-array-g5/

因子列表：80个（请查询以上链接）

芯片类型：

实验样本：

细胞上清

1、PYK2调节TAM浸润和乳腺癌生长

研究团队通过使用不同的基因小鼠模型，将野生型（WT）和PYK2敲除型（KO）乳腺癌（BC）细胞分别原位植入WT或PYK2ko/KO（PYK2 KO）C57BL/G小鼠，发现非受体酪氨酸激酶PYK2的缺失显著降低了乳腺肿瘤中巨噬细胞的数量。

2、剖析PYK2缺乏对乳腺癌细胞和TME的独特影响

研究团队为了进一步探索PYK2-KO减少TAM数量，从而抑制其促肿瘤作用并减弱BC生长的可能性，通过不同的小鼠模型系统比较WT和植入WT小鼠的PYK2 KOEO771细胞的肿瘤生长，结果发现在BC细胞或TME中”切除”PYK2可显著减少TAM数量，表明PYK2是单核细胞/巨噬细胞吸引所必需的,以及PYK2有效和选择性抑制剂的治疗潜力。

3、“切除”乳腺癌细胞PYK2可损害CCL2分泌、 NOTCH1信号转导以及巨噬细胞募集的影响

研究团队用Transwell分析法进一步研究了BC细胞中PYK2的缺失显著减弱巨噬细胞对肿瘤细胞的趋化性，结果表明PYK2的缺失调节癌细胞的分泌体，从而调节巨噬细胞的吸引力。紧接着，为了鉴定相关的分泌因子，研究团队使用细胞因子芯片（80个人细胞因子: AAH-CYT-G5；RayBiotech）分析了WT和PYK2缺失的人BT549和MDA-MB-231细胞（图3 C），结果显示，参与单核/巨噬细胞募集的几种细胞因子在两个PYK2缺失的TNBC细胞系的上清液中显著减少，如IL-1𝛽和其他趋化因子（CCL2、CXCL7、CCL7、CCL15）至少在BT549中显著降低。由于CCL2是在大多数实体瘤的单核细胞募集中起主要作用，并用ELISA验证（图3 D和E）进一步证实了该趋化因子的结果。（图3G-I）表明了PYK2对CCL2转录的影响，通过WB评估了NOTCH1和N1ICD，发现PYK2通过NOTCH1途径稳定N1ICD的蛋白水平（图4 A-C）来调节BC细胞中CCL2的转录，进一步证实BC细胞系中Notch1和CCL2之间的联系。

4、仅在巨噬细胞中”切除”PYK2足以减少肿瘤生长和巨噬细胞浸润

为了进一步阐明PYK2和TAM之间的功能联系，研究团队建立了巨噬细胞特异性PYK2-KO小鼠(简称 mφ-KO)，与 Mφ-WT 小鼠相比，Mφ-KO小鼠的肿瘤生长明显减少，24 天后平均减少 38% (图 5e)。通过 H&E染色肿瘤没有观察到明显的显微镜变化证明了 TAMs 对肿瘤生长的显著影响，以及PYK2在巨噬细胞-乳腺癌信号中起到关键作用。

5、PYK2敲除巨噬细胞的缺陷

如图5所示，选择性”切除”巨噬细胞中的PYK2可显著抑制肿瘤生长并同时降低TAM数量，这意味着”切除”巨噬细胞中的PYK2可导致细胞自主缺陷或损害其与肿瘤细胞的串扰。因此研究团队通过改良的Boyden小室迁移实验研究了巨噬细胞中PYK2”切除”对细胞移行的影响，并对WT和PYK2 KO BMDM的RNA序列数据进行了基因集富集分析（图6D），进一步证实PYK2缺陷影响了巨噬细胞迁移，其趋化性和整合素信号传导显著下调，结果强调了PYK2通过同时影响乳腺癌细胞CCL2释放和巨噬细胞CCR2蛋白水平来调节CCL2-CCR2信号的双重作用。

6、PYK2 调节巨噬细胞中的IL-4R信号传导并影响其促肿瘤发生表型

RNA序列分析表明，IL-4通路在PYK2-KO-BMDM中发生了显著改变（图6D和7A），为了验证PYK2对这一途径的影响，研究团队检测了IL-4受体(IL-4R)和IL-4R途径下游效应PSTAT6的水平，以及对照组和PYK2 KO Raw264.7和BMDMs组的水平，并对PYK2 KO巨噬细胞的进一步分析,结果显示巨噬细胞中PYK2的”切除”也降低了IL-4R的水平，IL-4R是促肿瘤发生极化所必需的主要受体，并强有力地降低了Stat6的活化。因此，Stat6靶基因的转录减少，导致较少的促肿瘤生成TAMs，减少血管生成和肿瘤生长。