【代谢组学】好的样本带来好的检测 | 代谢组学样本准备及送样手册（珍藏版）- 大数跨境

丰信生命科学

2024-11-28

导读：好的样本带来好的检测——"Good samples make good assays" – the problem of sourcing clinical samples for a standar

前言

生命科学是专业性和技术性极强的科学，样本准备是生命科学研究成败的关键。正如学术期刊《Clinical Chemistry and Laboratory Medicine》（2023 IF:6.8）早年发表的一篇文章标题所说："Good samples make good assays" – the problem of sourcing clinical samples for a standardization project. 绝对是正解！

样本准备基本原则

代表性和一致性原则	样本的取材部位、时间、处理过程等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。准确的分离病变组织和对照组织。取样部位不一致和不具有代表性会影响结果。
迅速性原则	样本质量是影响实验结果的最主要因素，用于研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地快，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
低温原则	样本离体后，立即在 4℃或冰上等低温条件下进行分离，分离好的样本立即置于液氮、干冰或 -80℃冰箱中直至实验，以避免目标代谢物的降解。

样本名称、包装、运输

样本名称

最好采用双重标记以防样本名称模糊；建议使用进口离心管。

标记 1：用高质量的油性笔在样本管上写上清晰、简单的样本名称，最好5个字符以内（不要写中文），用封口膜封好。

标记 2：将样本名称等信息写在标签纸上，贴在管壁上，最好用胶带粘贴牢固以防低温条件下样本标签脱落。

样本包装

按送样指导的要求准备样本，采用高质量离心管盛装样本。冷冻的组织，用高质量的2ml 的螺旋冻存管装载；离心管应用封口膜密封管口。不同类型和状态的样本运输过程中需要不同的保温条件，其中，需要干冰运输的，应尽量保证72小时内到达，添加15kg干冰即可；超过72小时的，应根据实际情况增加干冰用量。

邮寄样本

邮寄样本请附带完整的样本信息说明。建议自己存好备份样本。如样本有生物危险请提前咨询技术人员。邮寄样本应尽量保证在周一至五工作时间派送，务必避免五一、十一、春节等法定长假以及“双11”“双12”“6.18”等电商物流高峰期邮寄，以免发生不必要的风险。

代谢组学不同类型样本的要求及准备

01

血清

推荐送样量	NMR平台：500μl/样 GC-FID/GC-MS平台：200-300μl/样 LC-MS平台：200-300μl/样
样本收集	①采集血样，静置30分钟，血液凝固； ②取液体部分进行离心分离，4摄氏度，3000转每分钟（rpm），5分钟； ③离心后取上层清液（一般为淡黄色），每个样本至少需取500微升生物量，准确记录并进行编号。此过程中要求每个生物学重复样本所用的时间一致，而且血样在室温放置不超过3个小时，4摄氏度保存不应超过24小时，以防止血液中的代谢物发生变化； ④冰冻样本，将血清样本至于-80度冰箱冰冻。
注意事项	①采血过程中注意消毒，防止微生物污染； ②离心速率建议不宜过快，以免血细胞破碎； ③准确记录每个样本收集的血清样本体积； ④血清样本冰冻后避免反复冻融； ⑤在运输样本过程提供干冰保证低温（环境）; ⑥如果制备血浆样本，NMR平台宜用肝素钠抗凝，GC-MS、LC-MS平台宜用EDTA抗凝；如果计划做多平台组合，建议各平台都制备血清为宜，且需要提前分装保存。 ⑦用于NMR平台分析的样本如果储存在-80度环境超过3个月，则需要加入微生物抑制剂（建议添加叠氮化钠溶液（0.0025mol/L）20微升）；用于GC-MS、LC-MS样本不应添加任何微生物抑制剂。
温馨提示	①采血过程，除了要注意消毒，还要注意安全，采用专业器具，避免直接接触血液，以免感染； ②新鲜血液不宜久存，需要静置凝固，但应尽快处理，尤其在常温下保存时间最长不超过2小时，同时还应避免溶血； ③运输过程中需要用足量干冰保温寄送。多少干冰保温合适？这是个老生常谈的问题，理论上干冰越多越好，但考虑到干冰采购的运输成本问题，足量为宜，通常情况，30-35℃气温时，以每日不少于5kg挥发量估算为宜，同时应选用最快的物流方式。

02

组织

推荐送样量	NMR平台：50 mg冻干粉/样=500 mg鲜重/样 GC-MS平台：30 mg冻干粉/样=300 mg鲜重/样 LC-MS平台：30 mg冻干粉/样=300 mg鲜重/样
样本收集	①取得组织样本后迅速放入液氮速冻； ②在液氮条件下将冻好的组织样本研磨成粉； ③尽可能将样本研磨细腻和均匀； ④液氮研磨过程中液氮不宜过少，防止样本研磨过程中融化； ⑤液氮研磨成粉后，样本应在-80 ℃保存5 h以上或过夜存储，然后再于真空冷冻干燥机中抽为冻干粉状态； ⑥每个生物学重复需要提供至少50 mg/个的干粉生物量。
注意事项	如果样本还需要做其他检测，应提前分装保存，不应反复冻融。
温馨提示	①加液氮研磨过程中，注意戴手套，避免冻伤； ②绝大多数冷冻实验样本都有避免返复冻融的要求，应养成好习惯，尽量在初次冷冻之前分装； ③由于样本已制成冻干粉，所以运输过程不需要用干冰保温，但仍然需要用足量的冰袋，保证全程在4℃以下，同时应选用最快的物流方式。

03

贴壁细胞

推荐送样量	NMR平台：50 mg冻干粉/样=500 mg鲜重/样 GC-MS平台：20 mg冻干粉/样=200 mg鲜重/样 LC-MS平台：20 mg冻干粉/样=200 mg重/样
样本收集	方法1：针对培养基比较粘稠的样本 ①使用无菌刮刀沿着培养瓶的瓶壁轻轻刮取贴壁细胞； ②每个生物学重复取相同的一体积细胞悬浊液，经4℃，1000-3000rpm，5min离心处理，去除培养液（至少保证1Volume = N×107 cells，N>1。为得到最好的分析结果，建议每个生物学重复的在不计算管壁粘附的情况下湿重达到200mg以上）； ③将收集到的样本使用PBS或生理盐水清洗3-5次，经4℃、1000-3000rpm、5min离心处理，去除胞外物质； ④将收集到细胞样本在液氮中进行淬灭处理，抑制细胞中的代谢活性； ⑤将淬灭过的细胞样本放入-80℃储存；或进行冷冻干燥，最终得到冻干粉末，-80℃进行长期保存。方法2：针对培养基比较稀的样本 ①倾斜培养瓶将培养基尽可能的倒掉，去除培养基； ②加入适量的PBS或生理盐水，使用无菌刮刀沿着培养瓶的瓶壁轻轻刮取贴壁细胞； ③每个生物学重复取相同的一体积细胞悬浊液，经4℃，1000-3000rpm，5min离心处理，去除培养液（至少保证1Volume = N×107 cells, N>1。为得到最好的分析结果，建议每个生物学重复的在不计算管壁粘附的情况下湿重达到200mg以上）； ④将收集到的样本使用PBS或生理盐水清洗3-5次，经4℃、1000-3000rpm、5min离心处理，去除胞外物质； ⑤将收集到细胞样本在液氮中进行淬灭处理，抑制细胞中的代谢活性； ⑥将淬灭过的细胞样本放入-80℃储存；或进行冷冻干燥，最终得到冻干粉末，-80℃进行长期保存。
注意事项	①贴壁细胞在用无菌刮刀刮取的过程中，动作要轻尽量保证细胞完整，不被刮破； ②去除培养基和胞外物质的过程中，尽量选择低速离心，防止细胞破裂； ③采样全程保证容器无菌，避免外界容器对样本的污染； ④冻干样本如需长期保存建议进行过塑或充氮处理，湿样若长期保存建议-80℃储存； ⑤提前分装，避免反复冻融。
温馨提示	样本运输：冻干粉样本在运输过程中可使用冰盒运输，非冻干样本需使用干冰运输。参考文献：【1】Development and optimization of a metabolomic method for analysis of adherent cell cultures. *Analytical Biochemistry. 2010. 【2】Reducing Time and Increasing Sensitivity in Sample Preparation for Adherent Mammalian Cell Metabolomics. Anal Chem*. 2011.

04

悬浮、半悬浮细胞

推荐送样量	NMR平台：50mg冻干粉/样=500mg鲜重/样 GC-MS平台：20mg冻干粉/样=200mg鲜重/样 LC-MS平台：20mg冻干粉/样=200mg鲜重/样
样本收集	①每个生物学重复取相同的一体积细胞悬浊液，经4℃、1000-3000rpm、5min离心处理，去除培养液（至少保证1Volume=N×10^7cells，N>1。为得到最好的分析结果，建议每个生物学重复的在不计算管壁粘附的情况下湿重达到200mg以上）； ②将收集到的样本使用PBS或生理盐水清洗3-5次，经4℃、1000-3000rpm、5min离心处理，去除胞外物质； ③将收集到细胞样本在液氮中进行淬灭处理，抑制细胞中的代谢活性； ④将淬灭过的细胞样本放入-80℃储存；或进行冷冻干燥，最终得到冻干粉末，-80℃进行长期保存。
注意事项	①去除培养基和胞外物质的过程中，尽量选择低速离心，防止细胞破裂； ②采样全程保证容器无菌，避免外界容器对样本的污染； ③提前分装，避免反复冻融。
温馨提示	样本运输：冻干粉样本在运输过程中可使用冰盒运输，非冻干样本需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：冻干样本如需长期保存建议进行过塑或充氮处理，湿样若长期保存建议-80℃储存。

05

细胞培养液

推荐送样量	NMR平台：800μL/样 GC-MS平台：500μL/样 LC-MS平台：500μL/样
样本收集	①对细胞培养液样本进行编号以及做好采样信息记录； ②取细胞培养液大于1 mL，在4摄氏度保存，静置； ③取1 mL细胞培养液进行离心分离； ④离心后取800 uL /500 uL上层清液，冰冻样本，迅速将细胞培养液样本至于-80度冰箱冰冻，直到实验。
注意事项	样本冰冻后避免反复冻融，如果需要做其他生化检测应提前分装保存。
温馨提示	样本运输：运输过程中需要用足量干冰保温寄送。

06

唾液

推荐送样量	NMR平台：500μL/样 GC-MS平台：300μL/样 LC-MS平台：300μL/样
样本收集	①唾液样本需在静息状态下进行收集，收集前至少1小时避免进食、饮水、吸烟等（尽量不要接受外界刺激）； ②采集前应进行漱口（无需牙膏或漱口水漱口），除去食物残渣等杂质； ③收集唾液样本在4 ℃，3500 rpm，离心10-15 min，取上清液； ④收集好后迅速将唾液样本在-80 ℃保存，直到实验。
注意事项	①尽量在刺激少或安静的状态下进行唾液收集； ②女性受试者尽量避开生理期，收集唾液样本； ③唾液样本在进行前处理时保证每个生物学重复样本所有的时间一致； ④避免反复冻融，如果需要做其他生化检测应提前分装保存。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

07

鼻涕分泌物

推荐送样量	NMR平台：500μL/样 GC-MS平台：300μL/样 LC-MS平台：300μL/样
样本收集	①在鼻腔中加入无菌生理盐水约1-2ml，刺激鼻分泌功能，10秒后收集鼻分泌物； ②将鼻腔灌洗液反复剧烈摇动，进行均质化处理，混合均匀； ③将样本放在-80 ℃储存，直至测定。
注意事项	①鼻分泌物较多的可直接进行收集； ②收集过程中保证收集容器无菌，避免交叉感染； ③鼻分泌物样本在进行前处理时保证每个生物学重复样本所有的时间一致； ④避免反复冻融，如果需要做其他生化检测应提前分装保存。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

08

尿液

推荐送样量	NMR平台：500μL/样 GC-MS平台：300μL/样 LC-MS平台：300μL/样
样本收集	①对尿液样本进行编号以及做好临床样本的采样信息记录； ②取尿液大于1ml，在4℃保存，静置； ③取1mL尿液进行离心分离，4℃，10000rpm，5min； ④离心后取500ul上层清液，并加入微生物抑制剂[建议加叠氮化钠溶液（0.0025mol/L）20ul]； ⑤冰冻样本，迅速将尿液样本至于-80℃冰箱冰冻，直到实验。
注意事项	①为了排除样本（特别是女性样本）所引进的微生物干扰，NMR平台的样本需要加入生物抑制剂； ②尿液样本不能及时进行离心处理，务必放入到4℃的冰箱中静置保存，但不宜超过24h； ③尿液样本在进行前处理时保证每个生物学重复样本所有的时间一致； ④注意样本冰冻后避免反复冻融，如果需要做其他生化检测应提前分装保存。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。临床样本需要记录的信息：例如：性别；BMI；年龄；种族；饮食结构；过往病史；是否有其他疾病干扰；采样时间；采样方式；采样地；采样量等。

09

粪便

推荐送样量	NMR平台：500mg鲜重/样 GC-MS平台：300mg鲜重/样 LC-MS平台：300mg鲜重/样
样本收集	①取得粪便样本后迅速放入液氮速冻； ②迅速转入-80 ℃冰箱保存，期间不得反复冻融。
注意事项	①粪便样本在肠道里形成时间和区段不一样，含有微生物的量以及形成的成分不一致，因此所选择样本的节段不同，最终测到的代谢物也会因为个体的差异性而比较大； ②若不能确定是否选择同一节段的粪便样本，建议先取大量样本如8-10克鲜样，并将样本混匀后进行后续实验，避免带来的个体差异太大。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

10

微生物测序粪便

推荐送样量	16S/18S/ITS 扩增子测序：2-3g 宏基因组测序：3-5g
样本收集	①用无菌的粪便收集器或其他器皿收集新鲜粪便样本（最好以专用的无菌粪便取样器截取粪便中段里部，以减少外界环境对样本的干扰）； ②立即在实验室将收集到的粪便样本放在冰上用灭菌冻存管分装标记，按需分装，每管2-5g； ③分装后立即放入 -80℃保存（有条件使用液氮冻存后再放入-80℃保存）。
注意事项	如果需要做粪便微生物与代谢产物关联分析。则需要额外多取200-500mg左右的样本用于代谢组分析。且需要提前分装后冻存。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

11

细菌

推荐送样量	NMR平台：50mg冻干粉/样=500mg鲜重/样 GC-MS平台：20mg冻干粉/样=200mg鲜重/样 LC-MS平台：20mg冻干粉/样=200mg鲜重/样
样本收集	①4℃下离心收集样本； ②加入缓冲溶液或生理盐水（防止反渗透或细胞膜破碎）清洗样本3-5次，以去除培养液或胞外物质； ③将装有清洗好的样本的离心管（盖好管盖）直接放到液氮罐中淬灭细胞（无需研磨，此项过程的目的是灭活）； ④将淬灭过的细胞样本放入-80 ℃冷冻5h以上，然后使用冷冻干燥机进行干燥，最终得到冻干粉末。
注意事项	①为得到最佳谱图质量以得到最好的分析结果，强烈建议每个生物学重复的冻干粉量在不计算管壁粘附的情况下，至少达到50 mg以上； ②细菌样本量的含盐量保证低于0.9%； ③细菌样本中不含金属如Fe、Mn、Ni等； ④样本在清洗过程中尽量保证细胞不被破坏。
温馨提示	样本运输：冻干粉仅需普通冰盒运输即可。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

12

植物激素组织

推荐送样量	500mg鲜重/样
样本收集	①取得组织样本后迅速放入液氮速冻； ②在液氮条件下将冻好的组织样本研磨成粉，尽可能将样本研磨细腻和均匀； ③液氮研磨成粉后，样本应在-80℃； ④每个生物学重复需要提供500mg/个的生物量。
注意事项	液氮研磨过程中液氮不宜过少，防止样本研磨过程中融化。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

13

土壤

推荐送样量	GC-MS平台：①烘干粉末：1-2g/样；②湿样：4-5g/样（视含水率而定）
样本收集	1）用小铲子挖取需要测试层面上的土壤若干，尽快放入-80℃冻存，避免微生物的影响。如有条件带上干冰去取样。取完样后进行2）~3）或者4）处理。 2）烘干土壤： ①若需要检测易挥发和热稳定的代谢物烘干温度不宜过高，应在（55-60℃）； ②若不需要检测易挥发和热稳定的代谢物烘干温度应在（70-80℃）； ③计算含水率。 3）烘干后钢珠或玛瑙珠磨成粉末，将粉末按照送样要求分装，密封避免回潮，常温干燥保存与运输。 4）如果同时关心土壤和土壤中微生物的代谢物，那么取土壤分装，立即放入-80℃保存，送样干冰寄送。
注意事项	如果样本还需要做其他检测，应提前分装保存，不应反复冻融。
温馨提示	样本运输：①烘干粉末：常温干燥保存与运输；②湿样：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

14

固态发酵物

推荐送样量	NMR平台：500mg鲜重/样 GC-MS平台：200mg鲜重/样 LC-MS平台：200mg鲜重/样
样本收集	①取得样本后迅速放入液氮速冻； ②迅速转入-80℃冰箱保存，期间不得反复冻融。
注意事项	①样本在发酵器里位置不一样，含有微生物的量以及形成的成分不一致，因此所选择样本的位置不同，最终测到的代谢物也会因为个体的差异性而比较大； ②若不能确定是否选择的样本满足要求，建议先取大量样本如8-10g鲜样，并将样本混匀后进行后续实验，避免带来的差异太大析。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

15

淤泥

推荐送样量	NMR平台：5-10g /样 GC-MS平台：5-10g /样 LC-MS平台：5-10g /样
样本收集	稀样本收集： ①根据实验设计选择具有代表性的淤泥采样点； ②用无菌勺采集需要测试的淤泥样本若干，放入无菌取样袋或无菌离心管中； ③将收集的样本放入-80℃储存，直至分析。粘稠样本收集： ①根据实验设计选择具有代表性的淤泥采样点； ②用无菌勺采集需要测试的淤泥样本若干，放入无菌离心管中； ③比较粘稠的淤泥样本建议适度离心（建议4℃，10000 rpm，5 min），以除掉淤泥中的大部分水分，收集底部沉积物，后期分析过程中需要测定含水率； ④将收集的样本放入-80℃储存，直至分析。
注意事项	①收集过程中保证收集容器无菌，避免外界容器对样本的污染； ②在淤泥样本采集过程中，每个生物学重复的样本所采集的时间应保持一致； ③如有条件，建议带上干冰采样； ④如果样本还需要做其他检测，应提前分装保存，不应反复冻融。
温馨提示	样本运输：需使用足量干冰保温运输。长期保存建议：若长期保存建议-80℃储存。

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