前言
微生物群排泄和分泌的蛋白质（也称为分泌生物群）在微生物群与其宿主之间的交流中发挥着至关重要的作用。这些蛋白质包括酶、毒素和抗菌肽（AMPs）。抗菌肽是一种古老的、有效的抵御病原体（如细菌、古菌、真菌和病毒）的初级防御机制。它们没有酶活性，可以以单体或聚合体的形式发挥作用。此外，这些肽还能对细菌进行自身调节，通过群体感应相互交流，也能与真核宿主细胞交流，并调节毒力系统。在这方面，微生物群及其宿主可以产生用于微生物群-微生物群或微生物群-宿主相互作用的抗菌肽。
因此，通过研究微生物群产生的抗菌肽（microbial AMPs），我们可以更好地理解宿主与细菌在微生物组稳态中的相互作用。
AMPs的一般特性
与普通蛋白质相比，AMPs具有低分子量和最小的二级结构。公开数据库中报道的大多数AMPs是短肽，典型长度为5 ~ 50个氨基酸。但也有些肽段较长，超过200个氨基酸。而当只关注微生物群衍生的AMPs时，这些肽的平均长度为35 ~ 57个氨基酸。
图1 三类抗菌肽的三维结构
根据其结构，微生物AMPs 可分为三类（图1）。I类为分子量小于10 kDa的肽类，其结构与Microcins（微球菌素）相似（图1A）。这类肽可由两个α螺旋（如Glycosin F）、两个β折叠（如Microcin J25）（图1A）或两者组合形成，后者将肽链折叠成马蹄形结构；其N端或C端还可能存在未形成明确构象的肽段，例如Ruminococcin C（瘤胃球菌素C）（图1A）。II类包括分子量大于10 kDa的肽类，如Pediocins（片球菌素）型结构（图1B）。这类肽完全由占据大部分序列的α螺旋构成，代表性成员包括Lacticin Q（乳酸菌素Q）和Plantaricin J（植物乳杆菌素J）（图1B）。III类则由分子量约30 kDa的肽类组成，例如Bacteriolysins（溶菌素）（图1C）。这类抗菌肽具有与天然蛋白质相当的复杂空间结构，并可与其他离子结合（图1C）。
微生物AMPs的分子作用机制
图2 微生物AMPs的作用机制
微生物组调控中的微生物AMPs
所有高等生物都与栖息于其上的微生物群有密切的关系。AMPs是宿主和菌群共同产生的，对于相互交流和维持菌群稳态至关重要。此外，AMPs通过抑制潜在有害病原体的增殖，成为宿主防御第一道防线的一部分。另一方面，微生物利用它们通过操纵宿主或与微生物群中的其他微生物竞争来利用环境生态位。AMPs还可以调节物种特异性关联并影响细菌定植。
图3 AMPs在肠道微生物动力学中发挥的关键作用
人类肠道是揭示微生物与宿主（人体）相互作用的典型范例之一。其中，微生物与宿主来源抗菌肽（AMPs）的互作关系近年来受到广泛关注。人类肠道微生物群中一些最常见的 AMPs 生产者是芽孢杆菌和乳酸杆菌，它们是定植于上皮细胞的短暂细菌。这些微生物以产生细菌素和脂肽类抗生素而闻名，它们通过影响膜通透性来抑制潜在病原体的生长。此外，服用产生AMPs 的益生菌（如乳酸杆菌和肠球菌）可提高肠腔内的抗菌活性。丁酸弧菌属是另一类能够合成抗菌肽（AMPs）的微生物代表。研究发现，在运动诱导的应激反应后，该菌属在小鼠肠道内呈现显著丰度的定植。
基因组学应用于微生物组以发现AMPs
随着基因组科学（包括宏基因组学、宏转录组学、病毒组学和质粒组学）的发展，新的微生物组功能的发现也越来越多。由于组学技术的不同，侧重点也有所不同。宏基因组学涉及获取所有潜在的功能性AMPs，宏转录组学侧重于表达的 AMPs，病毒组学识别病毒中编码的 AMPs，质粒组学侧重于获取质粒中编码的 AMPs。
图4 从微生物组数据中获得AMPs的实验和生物信息学策略
如何通过实验测试AMPs的功能
要分析AMPs的潜在功能，首先需通过以下途径获取目标肽段：直接从宿主微生物中提取、化学合成，或通过细菌表达系统进行异源表达与纯化。在获得目标肽段后，其功能实验研究可分为三个关键步骤。第一步是抗菌试验，然后是体外细胞毒性试验，最后是用于临床应用的体内试验。这一过程如图5所示。
有多种方法可用于检测多肽的抗菌活性。最常见的方法有肉汤微量稀释法、琼脂扩散法、琼脂稀释法和kirby - bauer法。另一种有用的检测方法是最小抑菌浓度（MIC）测定法，该方法测量抑制目标微生物生长所需的肽的最低浓度。除了这些方法，还可以测试抗菌肽对病毒和真菌的功效以及抑制癌细胞生长的能力。
图5 用于临床使用的AMPs效应测试的典型步骤
在体外细胞毒性分析中，该过程包括将AMPs与哺乳动物细胞悬液孵育，并观察细胞的形态和活力的变化。活细胞用一种特定的染料染色，并与未暴露于肽的对照样本的数量进行比较。如果AMPs样品中染色的细胞百分比较低，则表明细胞毒性水平较高。测定细胞活力最常用的方法是MTT法，该方法测量黄色MTT 溶液被活细胞还原为紫色甲臜。另一种方法是乳酸脱氢酶测定，它可以测量受损细胞释放的 LDH。
在化妆品或制药行业使用AMPs 作为抗病原体的疗法时，必须通过体内试验。杀灭病原体的AMPs 给药系统可以是局部、静脉、腹腔、皮下、口服、鼻内或吸入。关键是要在试验过程中监测动物对多肽的反应，并根据需要调整剂量。
微生物源AMPs的未来与展望
微生物AMPs预测
抗生素的发现与应用是现代医学的里程碑，显著降低了感染性疾病的死亡率。但随其广泛使用，细菌通过基因突变等机制形成耐药性，致传统治疗方案疗效下降。流行病学显示，全球每年因耐药感染死亡达 127 万人，严重威胁公共卫生安全。因此，迫切需要发现抗生素的新方法。而抗菌肽是一种古老的、有效的抵御病原体（如细菌、古菌、真菌和病毒）的初级防御机制，是针对病原菌和多重耐药菌的非常有潜力的新化合物来源。
近年来，计算方法的出现加速了我们识别新型抗生素的能力，包括抗菌肽（AMPs）。其中，在2024年有多篇顶刊文献报道了从环境、宿主等相关栖息地（宏）基因组数据中发现新型抗菌肽的研究，扩大了相关资源库。
利用机器学习方法
从环境和宿主相关栖息地中识别AMPs
2024年6月一篇题为“Discovery of antimicrobial peptides in the global microbiome with machine learning”的论文在Cell上发表，该团队提出了一种针对微生物多肽识别的机器学习算法-Macrel，可大大降低抗菌肽（AMP）识别的假阳性率。基于该机器学习算法，从来自环境和宿主相关栖息地的（宏）基因组大数据集中识别了近百万条原核生物AMP序列，并建立了AMP综合数据资源（AMPSphere），其中很少与现有数据库匹配。
研究发现，AMP 的产生特定于栖息地，且其功效表现出菌株特异性。研究团队测试了 100 种合成的AMPs对11 种临床相关致病菌株和人类肠道共生菌的作用，共有 79 种 AMPs表现出针对病原体和/或共生菌的抗菌活性，其中63 种 AMPs成功抑制了被认为是公共卫生问题的ESKAPEE病原体的生长。此外，研究团队在小鼠感染模型中发现一些AMPs具有抗感染功效，相当于临床前小鼠模型中的多粘菌素B（一种商业临床抗生素，同样是AMP）。
利用机器学习方法
从人体微生物组中识别AMPs
2024年8月Cell发表了另外一篇从微生物组数据中挖掘抗菌肽的文章“Mining human microbiomes reveals an untapped source of peptide antibiotics”，该研究主要关注于人体微生物，从来自4个主要人体位点的1,773个宏基因组数据中进行AMPs的预测，包括皮肤、口腔、肠道等。最终得出了323个候选smORF编码肽（SEP）抗生素列表。
研究团队化学合成了其中的78个抗菌肽，并在体外对高优先级病原体和常见肠道共生菌进行了测试，发现了其中55个具有抗菌活性（70.5%）。它们通过靶向细菌膜、相互协同和调节肠道共生菌来杀灭细菌，这表明除了对抗病原体外，还在重新配置微生物组群落中发挥潜在作用。研究团队还进行了体内测试，在临床前感染动物模型中显示出抗菌活性，例如，人类肠道细菌普雷沃氏菌Prevotella copri产生的prevotellin-2具有与常用抗生素多粘菌素B相当的抗菌活性。
从组学数据中挖掘抗菌肽
随着基因组科学（包括宏基因组学、宏转录组学、病毒组学和质粒组学）的发展，新的微生物组功能的发现也越来越多。由于组学技术的不同，侧重点也有所不同。宏基因组学涉及获取所有潜在的功能性AMPs，宏转录组学侧重于表达的 AMPs，病毒组学识别病毒中编码的 AMPs，质粒组学侧重于获取质粒中编码的 AMPs。
从微生物组数据中获得AMPs的实验和生物信息学策略
参考文献：
【1】Santos-Júnior CD, Torres MDT, Duan Y, Rodríguez Del Río Á, Schmidt TSB, Chong H, Fullam A, Kuhn M, Zhu C, Houseman A, Somborski J, Vines A, Zhao XM, Bork P, Huerta-Cepas J, de la Fuente-Nunez C, Coelho LP. Discovery of antimicrobial peptides in the global microbiome with machine learning. Cell. 2024 Jul 11;187(14):3761-3778.e16. doi: 10.1016/j.cell.2024.05.013. Epub 2024 Jun 5. PMID: 38843834; PMCID: PMC11666328.
【2】Torres MDT, Brooks EF, Cesaro A, Sberro H, Gill MO, Nicolaou C, Bhatt AS, de la Fuente-Nunez C. Mining human microbiomes reveals an untapped source of peptide antibiotics. Cell. 2024 Sep 19;187(19):5453-5467.e15. doi: 10.1016/j.cell.2024.07.027. Epub 2024 Aug 19. PMID: 39163860.
扩展阅读
