一场漫长的遗忘丨世界阿尔兹海默症日- 大数跨境

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一场漫长的遗忘丨世界阿尔兹海默症日

派思维新生物

2022-09-20

导读：Know Dementia, Know Alzheimer's

你知道吗？全球每3秒即新增一位阿尔兹海默症患者。在我国，60岁以上人群约1500万人患阿尔兹海默症，随着我国社会老龄化程度加深，预计到2050阿尔兹海默症患者将达4898万，这将给国家带来巨大的经济和社会负担。

派思维新拥有丰富的干细胞相关的模型经验，公司为全内资公司并有相关的人遗备案，其模型构建和治疗药物相关的供体来源合规合法。团队经验丰富，项目涉及肿瘤，炎症和自身免疫疾病，代谢类疾病等多种药理模型。

阿尔兹海默的临床诊断与模型构建

背景信息：

阿尔兹海默症（Alzheimer's disease）简称AD，俗称老年痴呆，是一种过程缓慢且不可逆的，以记忆功能和认知功能退化为特征的临床综合症，多发于老年期。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD的机制涉及多种假说，主要有β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性、氧化应激、Tau蛋白异常磷酸化等，但发病机制尚未明确。

2012年《新英格兰医学杂志》上发表的一项对比研究结果显示，在发病的20年前，阿尔兹海默症的进程就已经开启。文中首次提议β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性的有无，可能是治疗AD的主要原因，至今已被类文献引用超2300余次。

药物治疗与预后

（1）认知功能缺损的治疗

胆碱酯酶抑制剂（AchEIs）是研究得最多的一类药物，也是到目前为止临床证实疗效比较好的药物。临床上使用的胆碱酯酶抑制剂主要有以下几种：

多奈哌齐（Donepezil，E2020），推荐起始剂量是5mg/d，1周后剂量可增加至10mg/d。推荐剂量为10mg/d。
重酒石酸卡巴拉汀（Rivastigmine），可给药2次/d，推荐剂量为6～12mg/d。
加兰他敏（Galantamine），给药2次/d，推荐剂量24mg/d。
石杉碱甲（Huperzine A），常用剂量是0.15～0.3mg/d。

（2）精神症状的治疗

主要用于治疗精神病性症状，如幻觉、妄想和冲动攻击行为等。阿尔茨海默患者由于脑器质性病变和躯体衰老，对抗精神病药的耐受性较差，治疗剂量通常只需1/3～1/2的成人剂量。

氟哌啶醇的起始剂量为1～2mg/d，推荐计量为2.5～5mg
奋乃静的起始剂量为2mg/d、推荐计量为2.5～5mg
舒必利的起始剂量为100～200mg/d
非典型抗精神病药利培酮起始剂量为05～1mg/d
奥氮平起始剂量为2.5～5mg/d
抗抑郁药：如5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）：氟西汀20mg/d，帕罗西汀20mg/d，舍曲林50mg/d，氟伏沙明50mg/d，西酞普兰20mg/d。
抗焦虑药：主要是苯二氮类药，一般可分为长效制剂（半衰期约20h）如地西泮、氯硝西泮、氟西泮等；中效制剂（半衰期约12h）如阿普唑仑、氧西泮、劳拉西泮等；短效制剂（半衰期约3h）如三唑仑、咪达唑仑（也称速眠安）等。半寿期较短的药物多用于入睡困难，半寿期较长的药物适合焦虑、激惹和睡眠的维持治疗。

（3）预后

阿尔兹海默症因为作用机制尚未明确，所以目前没有有效的药物治疗方法，不能有效遏制阿尔茨海默病的进展，通常病程5～10年，有报道显示可更长。运动、社交、饮食调节、适当的脑力劳动、充足的睡眠与减压等是有效的预防方案。

构建AD体外/体内模型

目前，AD的机制涉及多种假说，主要有β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)毒性、氧化应激、Tau蛋白异常磷酸化等。研究AD的方法主要包括动物模型和细胞模型。动物模型能真实模拟动物体内AD的病理特征；而细胞模型能在微观层面研究AD的发病机制，并可根据研究目的的不同选择构建适宜的细胞模型。

一、AD细胞模型的构建方法

AD细胞模型具有来源丰富、干扰因素小、实验条件可控且评价机制灵活等特点，是目前研究神经生物学及神经药理学的重要方法。AD造模试剂依据诱导机制的不同分为神经毒性损伤、氧化应激损伤及Tau蛋白过度磷酸化等；适用细胞系主要包括人神经母细胞瘤细胞、NG108-15细胞、N2a细胞、PC12细胞等。AD类细胞模型主要研究方向是1)细胞凋亡（检测凋亡蛋白、凋亡率等）；2)细胞氧化应激损伤（检测细胞ROS、GSH、GSH-Px、MDA以及其它氧化指标）；3)炎性反应（检测细胞炎症因子如TNF-α，IL-2.IL-4等）。

1、神经毒性损伤型造模试剂

1.1 Aβ

Aβ来自于其前体淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)第672-711残基裂解片段，长度在39-42个氨基酸的短肽。目前常采用20μM的Aβ1-42或Aβ25-35诱导细胞建立AD细胞模型。

doi: 10.1016/j.febslet.2015.05.035

doi: 10.22038/IJBMS.2017.8847

1.2 谷氨酸(glutamate，Glu)

谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质，同时也被认为是新皮质和海马锥体神经元的主要神经递质，涉及认知功能等方面。目前常采用10 μM的谷氨酸浓度诱导细胞建立AD模型。

1.3 甲醛(formaldehyde，FA)

甲醛是毒性最强的有机化合物之一，可促进AD的主要病理特征形成，包括Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化和神经元丢失，同时伴有细胞功能障碍甚至细胞凋亡。常采用0.35 mM的FA诱导N2a细胞，建立AD模型。

doi: 10.3389/fnins.2016.00598

2、氧化应激损伤

2.1 过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)

过氧化氢是一种强氧化剂，可诱导体外细胞产生ROS，抑制细胞增殖，并氧化脂质、蛋白质和DNA等细胞内大分子，产生过量的脂质氧化物及自由基等，导致组织损伤和细胞死亡。此外，研究显示H2O2可通过c-Jun N-末端激酶诱导β-分泌酶的启动子活性，导致APP表达增加和Aβ积聚，从而诱导神经细胞凋亡。

doi:10.1074/jbc.M800013200

2.2 Tau蛋白过度磷酸化

大量研究证明，Tau蛋白过度磷酸化在AD疾病中起着重要作用。冈田酸(okadaic acid，OA)是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制磷酸酯酶活性，使蛋白高度磷酸化。体外研究表明，经OA处理的神经细胞，Tau蛋白Ser-262位点磷酸化水平明显升高；同时，OA具有神经毒性，引起神经元细胞突触损伤。因此，OA可用于制备Tau蛋白过度磷酸化的AD细胞模型。

doi: 10.3389/fphar.2018.00682

3、细胞模型的建立及评价指标

3.1 人神经母细胞瘤细胞

人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和SH-SY5Y常用于研究AD发病机制。研究表明SK-N-SH细胞经10μM全反式维甲酸诱导分化后细胞突触明显伸长、突触素表达明显升高等典型的神经元特征。而SH-SY5Y细胞系是SK-N-SH细胞系的一个亚系，并经历3次克隆选择产生(SK-N-SH→SH-SY→SH-SY5→SH-SY5Y)。同时，该细胞经诱导剂维甲酸诱导分化后，引起多巴胺能神经元特征加强，具有高表达的囊泡单胺转运体1(vesicular monoamine transporter1，SLC18A1)、多巴胺受体D2(dopamine receptorD2，DRD2)。

目前，常用于诱导人神经母细胞瘤细胞建立AD模型的造模试剂包括：Aβ、H2O2、AGEs、GA、OA、SiNPs等，其诱导时间大多为24h或48h。检测指标主要有细胞活力、凋亡率及相关凋亡蛋白表达、氧化应激相关指标、Tau蛋白磷酸化水平等，具体详情见Tab1。

3.2 小鼠神经母细胞瘤细胞(mouse neuroblastoma cells，N2a/Neuro-2a)

N2a细胞作为体外研究AD发病机制的常见细胞模型从A株白化鼠的自发性肿瘤而建立，呈神经元样。研究常采用Glu、FA、SiNPs等物质诱导N2a细胞建立AD模型。经造模试剂诱导后N2a细胞常出现Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、氧化损伤、细胞凋亡等AD样的病理学特征。具体造模方法见Tab1。

3.3 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(rat phcochromocytoma cell，PC12)

PC12细胞常用于神经系统疾病的体外研究。常采用Aβ25-35、Glu、H2O2等诱导PC12细胞建立AD细胞模型，其药物处理时间为24h或48h。PC12细胞经造模试剂诱导后主要涉及氧化损伤、细胞凋亡等方面。具体造模方法见Tab1。

OA可引起成熟的神经元细胞突触的损伤

doi: 10.22038/IJBMS.2017.8847

表1：AD细胞模型的造模模式与评价指标

体外模型综述

目前采用Aβ、Glu、H2O2诱导SH-SY5Y，N2a/Neuro-2a与PC12细胞建立AD细胞模型，揭示AD的细胞凋亡、炎性反应、氧化应激损伤等机制。另外，也采用OA诱导细胞模拟AD的Tau蛋白磷酸化机制。未分化和分化的细胞均已用于AD的体外实验。分化后细胞的形态结构、生化特点及功能特征更接近神经元。

除基因转染技术外，诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技术也发展迅速。研究发现iPSCs也用于AD细胞模型的建立。从AD患者体细胞重新编程产生iPSCs，经分化后获得的神经元表征出了Aβ以及Tau蛋白过度磷酸化等AD早期病理特征；同时，研究发现干细胞也可用于治疗AD或延迟其疾病的发生。

仍有部分亟待解决的问题：细胞培养过程中各种代谢中间体、离子、血清成分和底物如何影响细胞的生长和分化有待进一步研究；比较缺乏与临床微观病理特点完全契合的细胞模型建立方法和统一的模型标准评价体系。有必要系统地引入多维度、多致病因素复合的AD细胞模型构建方法，以期为模型标准化评价及靶向治疗AD的有效途径以及策略提供思路与借鉴。

二、AD体内模型的构建方法

2.1 双侧海马立体定向注射Aβ1-42诱导阿尔茨海默症小鼠模型

2.2 慢病毒构建及基因敲除

除了散发型AD(sAD)外，已知APP、PSEN1和PSEN2等基因的突变会引发家族型AD(fAD)。表达人类APP突变体(K670N/M671L、V717I、V717F和D23N系)， PSEN1(PS1系)和PSEN2(PS2系)突变体的小鼠均表现出渐进的、早发型的痴呆症状，但都缺乏神经元纤维缠结的形成。目前，已有成熟的双转基因APP/PS小鼠和三转基因3×Tg小鼠系(包含人类APP、PS1突变和Tau突变)模型用于AD研究。5×FAD小鼠系是结合三个人类APP突变体和两个PS1突变建立起来的，该小鼠模型更早地出现淀粉样病变、认知障碍及神经元损失。这些多转基因小鼠较单转基因小鼠的病理表现与阿尔兹海默症更相似，具有更高的应用前景。不过这些模型难以评估一些新发现的基因突变是否对AD的发生发展有影响。

2.3 Morris 水迷宫验证模型

Morris 水迷宫中黑色水池直径150cm，高60cm。隐形平台（10×10×28cm）或圆形透明平台。圆桶中注水高度45cm，平台位于水面下1cm。水温维持在20-22°C，水中加入染料混匀使平台隐蔽。

实验分为三个阶段。⑴适应期：实验开始前1天每只小鼠置于水迷宫实验室以适应周围环境；⑵训练期：在前 5 天的定位航行实验中，每天测试 4 次，均从不同的象限入水。每轮实验将小鼠从设定的入水点面向池壁放入水中。如果 60s 内实验小鼠爬上隐蔽站台，并在站台上停留时间超过 5S，视为找到平台。从入水到寻台成功的时间记录为逃避潜伏期。如果小鼠在 60s 内没有寻找到平台，将会引导其至平台上并驻留 10s，逃避潜伏期记录为 60s。计算每天 4 次逃避潜伏期的平均值为平均逃避潜伏期。⑶记忆保持测试期：在第 6 天的空间探索实验中，水下的平台被撤去，选择平台对面的象限作为入水点，记录小鼠在 60s 内穿越原平台位置的次数为穿越平台次数，作为反映小鼠空间记忆能力的指标。

Morris 水迷宫验证模型 doi:10.3791/2920 (2011)

2.3.2.避暗实验

避暗实验分为三个阶段。⑴适应期：每只小鼠放进明箱后先适应5min，可在明暗箱之间自由活动。⑵训练期期间，小鼠(四肢)完全进入暗箱后，立即将中门关上，并给予一次电击。电击后让小鼠在暗箱内停留 10s，使小鼠形成暗箱与电击之间的联系。将实验小鼠放回原笼。⑶记忆保持测试期，小鼠电刺激训练结束1h和24h后，小鼠放回明箱，中门打开，不给电击。

录像系统和图像分析系统记录如下数据:

避暗潜伏期：小鼠第一次进入暗箱并被电击的时间。3min 内未进入暗室的小鼠其潜伏期按180s。计算潜伏期越长，反映动物记忆越好。

避暗错误次数：3min 内，小鼠总共进入暗箱并被电击的次数。

doi: 10.7150/thno.44152

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引用文献

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2：Sadeghnia H R, Kolangikhah M, Asadpour E, et al. Berberine protects against glutamate-induced oxidative stress and apoptosis in PC12 and N2a cells[J]. Iran J Basic Med Sci, 2017, 20(5): 594-603.

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9:Shen YY, Hua LC, Yeh CK, Shen LM, Ying M, Zhang ZJ, Liu GP, Li SP, Chen SP, Chen Xand Yang XF. Ultrasound with microbubbles improves memory,ameliorates pathology and modulates hippocampal proteomic changes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.Theranostics 2020; 10(25): 11794-11819.

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