欢迎来到最新一期Discovery@VIVA，继上期后，后台的许多小伙伴纷纷要求追更，敦促小编揭秘维亚生物的最新技术平台——冷冻电镜。这不，我们再次请到了维亚生物总裁任德林博士，来给我们讲解目前“风头正劲”的冷冻电镜（Cryo-EM）平台。在基于SBDD的新药研发流程中，冷冻电镜将为行业带来什么样的突破和改变？是否能解决过往传统方式无法攻克的难题？且听任博为我们道来。
任德林博士
维亚生物总裁
密西根州立大学动物科学博士、生物化学博士后；
20多年药物研发从业经历，曾任辉瑞高级研究员；
于2009年加入维亚生物，自2017年起担任维亚生物科技有限公司执行董事兼总裁，全面负责维亚生物研发外包业务（CFS，服务换现金业务）。
*感谢刘智博士、李晓润博士为本文技术部分提出意见和建议
结构决定功能。准确解析结构信息可为新药研发提供重要的基础生物学信息。
自上世纪五十年代以来，结构解析已经成为人类理解各种基本生命过程分子机制的重要途径。其中，蛋白质作为在生命中维持细胞功能秩序的主要分子机制被广泛研究。科研人员通过主流的结构解析方法，如 X射线晶体衍学（点击Discovery@VIVA | SBDD-基于结构的药物发现，创新药的金钥匙（一）了解更多）和核磁共振（NMR）等技术，已解析了大量蛋白结构，目前PDB库（http://www.rcsb.org/）中绝大部分蛋白结构都是通过X-射线技术获得，这些结构的测定极大丰富了人类对细胞中各种重要蛋白作用机制的理解。但是，通过X射线解析晶体衍射技术获取结构信息依然存在多种限制。首先，结晶过程较为耗时，通常只能适用于单一纯化的蛋白（单体或二聚体），且某些复杂蛋白难以结晶。此外，蛋白结构只能在细胞环境外进行测定，因而会丢失部分重要的人体环境信息。
是否有一项解析方式，可以突破上述限制，更好、更快地完成大型复杂结构的解析？此刻，一项新兴技术——冷冻电镜，走进了维亚生物的实验室，它或许可以为我们带来新的机遇。
//冷冻电镜是“谁”？
冷冻电子显微技术（简称“冷冻电镜”），是指利用透射电子显微镜对迅速被冷冻在玻璃态冰的生物样品进行低温（一般为液氮温度-196℃）观察，并通过后期的图像处理获得目标样品结构信息的技术。电镜的发展历史最早可追溯到1931年，德国科学家恩斯特首次发明了透射电子显微镜，研究人员由此开始利用电镜观察高分辨材料结构。1984年Jacques Dubochet（2017年诺贝尔化学奖获得者之一）研究组首次发表处于无序冰中的病毒颗粒数据，标志着现代意义上的冷冻电镜制样方法的诞生。
然而，早期冷冻电镜技术受限于分辨率较低、数据收集技术不成熟等缺陷，在很长一段时间内未得到广泛应用，大众对其的了解非常有限。直到2017，瑞典皇家科学院宣布将年度诺贝尔化学奖颁给发明冷冻电镜的三位学者，冷冻电镜正式“加冕”，方得以走入大众视野并进入下一个快速发展阶段。
（2017年诺贝尔化学奖得主：瑞士洛桑大学生物物理学荣誉教授Jacques Dubochet，哥伦比亚大学教授Joachim Frank，英国分子生物学实验室Richard Henderson）
值得一提的是，本次抗击新冠病毒的过程中，冷冻电镜的技术也做出了诸多贡献。多名国内外科研专家已通过冷冻电镜完成了新冠病毒刺突蛋白、新冠病毒受体 ACE2，及新冠病毒表面 S 蛋白等多个重要蛋白及复合物结构信息的高分辨解析，对后续研究新冠病毒的感染机理及特效药物、疫苗的开发都有着重要的指导意义。
（ACE2全长结构的解析）
//复杂结构的破局者
正如引文所提到的，被业界广泛使用的X射线晶体学并非万能。在应对膜蛋白、多亚基蛋白复合体等靶蛋白时，X射线衍射结晶学往往显得力不从心，一旦缺乏高质量的晶体，X射线衍射的结果往往就会不理想。因此，随着靶标越来越具有挑战性，解析药物靶分子或生物制剂的结构不仅耗时长久，靶标制备难度也日益上升。以膜蛋白为例，作为细胞膜的组成部分，膜蛋白在能量转换、物质运输、信息识别和传递等活动中执行重要的功能。然而，由于膜蛋白丰度低、疏水性强、在非膜环境下稳定性低和不易结晶等特点，其高分辨结构研究一直以来是业界的难点课题。
是否可以不通过结晶的步骤，直观地给复杂蛋白样品进行“拍照”，从而获取蛋白或蛋白复合物的结构信息？近十几年，得益于电子探测器的技术突破和计算和图形处理技术的快速发展，冷冻电镜可获取的结构分辨率极大提高，迎来了“分辨率革命”。
与X射线衍射晶体不同，X射线衍射晶体样品由多个蛋白大分子规则排布形成的，需要在不同角度进行衍射以收集结构信息。而借助冷冻电镜时，研发人员无需制备晶体，仅需少量的处于近天然状态溶液的蛋白样品即可确定大分子复合物结构。借助冷冻电镜实验还可以一次性从同一样品获得蛋白的不同构象状态下的结构。通过对同一蛋白样品进行大量的独立拍摄，再通过计算机整合图像，以平均的方法提高信噪比得到分子结构，这就是最广泛应用的冷冻电镜“单颗粒（single-particle）技术”。近年来，这一技术已为过去不适合结晶的蛋白提供了许多高分辨率结构，包括大型动态复合体及膜蛋白。
（冷冻电镜单颗粒技术示意图）
此外，结构生物学家不仅能够借助冷冻电镜研究蛋白质和病毒的功能状态下的结构，还能够确定这些样品如何与其他标记分子或化合物相互作用。冷冻电镜可广泛应用于研究病毒进入细胞的机制，或观察膜蛋白如何依赖其疏水环境来决定其结构和功能。
//加速新药发现进程
冷冻电镜作为一种可分析分子组装体的强大生物物理技术，正在改变药物设计的理念策略。靶蛋白结构研究要求在尽可能反映蛋白生理功能的条件下研究分子机制，要保持分子结构处于其功能状态，应在其天然水合环境下于溶液中研究样品，这与冷冻电镜的特点完美契合。在玻璃态冰中冷冻的蛋白质样品，可以在接近天然、完全水合的状态下进行数据收集，获得蛋白生理状态下的结构，从而加快基于结构的药物发现，并且为功能多态性和构象动力学研究提供了极大的技术潜能。
在过去的科研发展中，冷冻电镜已经证明了其在药物靶标鉴定、验证等方面具有很高的实用性，针对目标蛋白结构分析可帮助理解其作用机制，评估药物适用性。尽管在设计全新先导化合物中尚罕有使用冷冻电镜的例子，但针对制药行业的部分应用，冷冻电镜已呈现出了许多优势和便捷性。
实际上，化合物结构并不需要总是达到3埃以下的分辨率才能被研发人员应用，稍低分辨率结构也可以帮助科研人员更好地理解目标蛋白、并对识别位于蛋白质复合物的结构域或结合伴侣之间的结合口袋提供思路。通过冷冻电镜，科研人员可以有机会深入了解小分子与大分子组装体之间的相互作用，助力新药研发从苗头化合物向先导化合物的过渡。尽管冷冻电镜解析的结构分辨率通常受蛋白质动态变化导致的构象多样性限制，但借助重构各种中间状态，可以帮助科研人员理解复合体如何与其底物结合的机制，也一定程度地助力了基于结构的药物发现。
//SBDD一体化服务
加速赋能新药研发产业链
近些年来，冷冻电镜技术已不再局限于基础研究的范畴，进一步应用到了小分子药物发现与制备工艺，抗体研发，疫苗研发，基因治疗研发与制备工艺等多个方向。诚然，冷冻电镜技术在很多方面还存在不足。冷冻电镜目前每个数据采集需要跨越数天的时间，通量远小于传统的晶体学结构解析；结构的分辨率也距离X射线衍射晶体有一定差距。但是随着软件、硬件的进一步升级，冷冻电镜在未来必会得到更广泛的运用。据Science预测，未来通过冷冻电镜解析的结构的蛋白质结构数量将以每5年10倍的速度增长，与目前主流的X射线晶体衍射技术及NMR等方法将形成有效互补。
作为技术驱动型的创新药研发服务平台，维亚生物通过自建冷冻电镜技术平台，已经针对可溶性蛋白颗粒、膜蛋白及大型蛋白复合物等靶标展开服务，并将持续优化操作流程，提高冷冻电镜研究通量。在基于冷冻电镜技术的结构解析中，高质量的蛋白质样品是取得高分辨结构信息的关键。维亚生物于蛋白质表达领域拥有大量的研究基础和技术积累，从源头保证蛋白样品的稳定性和均一性，为冷冻电镜的高质量观测解析提供坚实的前期准备，免除了客户蛋白运输、蛋白性质不稳定的一系列潜在风险。针对难表达的蛋白，维亚生物也具有业界领先的改造、解决技术。依托SBDD领域的丰富经验与全球领先的技术平台，维亚生物在质粒构建、蛋白表达与纯化、蛋白负染、冷冻筛选、高分辨率数据与处理及单颗粒分析等业务领域提供一站式服务，并积极构建完整产业链，致力于为客户提供从基因到临床药物的全流程解决方案。
