不同样本保存液的成本及性能对比分析

不同样本保存液的成本及性能对比分析

随着疫情的逐步发展，核酸检测也是百花齐放，门槛越来越低，各种产品参差不齐，价格也是有高有低，那么这些产品在性能方面有那些差别呢？是否只是存在价格上的差异，有些产品甚至性能还不如单纯的PBS（磷酸盐缓冲液）？到底异硫氰酸胍和盐酸胍存在哪些区别？

下面，我们就产品原料成分、灭活效果及样本保存效果等几方面来做详细说明。

1、原料成分

灭活型样本保存液主要成分有缓冲液、表面活性剂、胍盐、稳定剂和络合剂以及PH调节剂等成分组成。

缓冲液的作用是稳定PH值；表面活性剂和胍盐是蛋白变性剂，有着各自不同的作用；胍盐具有的光和热的不稳定性，稳定剂是必不可少的；络合剂可以络合金属离子，避免金属离子对PCR荧光扩增的干扰；PH调节剂作为调整PH值的主要成分，作用也是至关重要的。

不同PH值颜色差异，与其他物质及含量无关

缓冲液和PH调节剂可以让保存液稳定在一个弱酸或者弱碱的范围，这个时候保存液是黄色或者橙红色，采样拭子浸泡后，随着拭子上酸性胶的溶解，采样后的试管内保存液呈黄色，偏酸性。为什么保存样本的保存液要呈弱酸性呢？因为病毒的核酸是RNA，单螺旋结构，在弱酸性条件下更稳定，对应的，DNA为双螺旋结构，在弱碱性条件下更稳定。

市场上，我们看到很多保存液呈粉紫色，其PH值在8.5以上，采样后仍呈粉红色，说明PH偏高，是非常不利于病毒核酸样本保存的。

胍盐作为一种强蛋白变性剂，是裂解的主要成分，高浓度的胍盐能够抑制Rnase的活性，是防止核酸降解的主要成分，这也是我们一贯强调胍盐浓度的主要原因。那么盐酸胍和异硫氰酸胍有什么区别呢？通常认为，盐酸胍和尿素等蛋白变性剂对蛋白变性的可能是可逆的，盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用。因为盐酸胍具有形成氢键的能力，盐酸胍在高浓度(4~8mol/L)水溶液时，可以破坏水的氢键结构，盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加，从而使蛋白质发生不同程度的变性。在蛋白变性速度上，盐酸胍是明显慢于异硫氰酸胍的，另外，盐酸胍的稳定性也差很多，因此，盐酸胍产品的有效期会短很多，这在大面积的核酸筛查中不明显，一旦库存放置时间较久，产品性能就会出现大幅度下降，甚至不符合要求。

表面活性剂的变性效果表现在溶解膜蛋白、破裂细胞、释放核酸，还具有一定的去污、助溶能力等方面。因此，没有表面活性剂的无泡产品，不仅核酸释放率会较低，还会存在灭活速度慢，灭活不彻底等情况。病毒样本存在传染性的可能。

稳定剂成本较高，但是可以有效的保持胍盐的稳定性，因此也是必不可少的成分。

目前市场上的绝大部分低价产品，主要通过降低胍盐含量、用盐酸胍替代异硫氰酸胍、不添加稳定剂等方法来降低成本。

2、灭活效果

我们通过对市场上两款低价产品（售价在10元/L左右的产品）及尚飞生物的灭活型保存液进行灭活性能比较。通过电镜成像法及慢病毒转导试验进行测试。在两种测定中，PBS溶液均用作病毒样品保存溶液的参考对应物。结果如下：

结果显示，10分钟后，两款低价产品均可观察到病毒颗粒，与PBS溶液效果相差不大，病毒未能完全灭活。而尚飞生物的保存液内无法观察到完整的病毒颗粒，病毒被完全灭活。

通过慢病毒培养，结果如下：

室温保存10分钟后，慢病毒被完全灭活，GFP表达实验中无法观察到病毒的转染活性。

3、样本保存效果

将定量的流感病毒分别加入PBS缓冲液对照组，及三种不同的样本保存液内共计4组8支试管，PBS立刻进行核酸提取并做荧光PCR扩增，其余三组6支试管在低温2-8℃放置72小时后，然后对样本进行核酸提取并做荧光PCR扩增，具体数据如下：

三种样本保存液在低温保存72小时后，均可进行PCR扩增，并能进行判定，CT值差异不大，说明在低温下，核酸片段保存完整，出现核酸降解的幅度不大。

为了进一步凸显差距，我们将四组样本在室温25℃存放48小时后对样本进行核酸提取及荧光PCR扩增，具体数据如下：

结论：PBS及其余两种保存液均出现核酸降解，这是核酸酶没有被完全抑制住活性或者金属离子存在的原因。如果不考虑灭活性能，PBS溶液亦能满足要求，三种保存液在目前检测模式下虽有一定差距，但是都能进行结果判定。

随着保存条件的变化，两款低价产品核酸降解速度明显更快，样本保存效果较差。