结直肠癌类器官-间质生物样本库可用于个体化治疗响应的亚型特异性评估

文献解读

结直肠癌类器官-间质生物样本库可用于个体化治疗响应的亚型特异性评估

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是全球男性中第三大常见恶性肿瘤，女性中第二常见癌症。一半以上的CRC发生在较发达的地区，高收入国家的发病率和死亡率最高，然而低收入和中等收入国家的病例数量一直在上升，在我国恶性肿瘤的发病率中CRC位居第二。2023年3月1日，美国CRC发病率和死亡率最新统计数据《Colorectal cancer statistics, 2023》发布在CA: A Cancer Journal for Clinicians杂志上。报告全面分析了CRC最新的发病、死亡和患者生存的情况及变化趋势，尽管CRC的总体发病率和死亡率在持续下降，但CRC的疾病负担正迅速转向更年轻的患者且有更多向晚期转移的趋势。CRC分期越晚，患者五年生存率越低，由于缺乏有效的治疗方案，被诊断为CRC4期的患者5年生存率只有11%，目前迫切需要新的、更有效的癌症筛查和治疗策略。

CRC不是单一的疾病，而是结肠内出现的异质性恶性肿瘤，其取决于肿瘤细胞及其周围基质之间复杂的相互作用，并在很大程度上依赖于肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中肿瘤和周围细胞的可塑性。全球公认的分类系统将结直肠癌和分层患者的共识分子亚型（Consensus molecular subtype，CMS）定义为四个亚组（CMS1-4）。其中，CMS4预后最差，与肿瘤转移和化疗耐药有关。

患者来源的肿瘤类器官（PDOs）已成为重要的CRC临床前研究模型，目前，已建立了有效的类器官培养方案，可从人类结肠的正常组织和肿瘤组织中高效地衍生类器官。多项研究表明，活体类器官生物样本库可以准确地重现CRC患者之间和患者自身的肿瘤异质性。最近，也有联合临床试验显示CRC类器官对患者个体化治疗反应具有很高的预测价值，在个性化测试方面显示出了巨大的潜力。然而，PDTOs不能充分再现各种分子亚型的细胞环境。考虑到基质细胞的重要性，特别是对于CMS4亚组肿瘤的预后，PDTOs单独培养很可能在预测临床反应方面受到限制。

近期，德国Georg-Speyer-Haus肿瘤生物学与实验治疗研究所、歌德大学法兰克福癌症研究所、德国癌症研究中心等多家研究机构合作，建立了可以更好地反映分子亚型依赖性，提高药物检测水平的结直肠癌类器官-间质生物样本库。相关研究成果 2023 年 7 月在线发表于《Cancer Discovery》（IF=28.2）杂志上，题为“Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses”（结直肠癌类器官-间质生物样本库可用于个体化治疗响应的亚型特异性评估）。

该研究建立了30名患者PDOs与肿瘤成纤维细胞（CAFs）匹配CRC类器官基质生物样本库。特异性表型分析表明，异种移植或与CAFs共培养可提高转录组的保真度，并指示亚型特异性基质基因的表达。此外，共培养的功能分析揭示了CMS4患者对吉非替尼和SN-38的特异性治疗耐药以及预后表达特征。化学基因组文库筛选确定了基质耐药的患者和治疗依赖机制，包括共同靶点MET。该项研究结果表明，CRC表型在癌症上皮中以一种可塑性的、强依赖于环境的方式加密。因此，CAFs对于体外真实的重现分子亚型和治疗反应是必不可少的。

为了反映CRC的临床异质性，研究者们构建了来源于不同部位和病程的30例由肿瘤PDOs与CAFs构成的CRC类器官-间质生物样本库。类器官形态呈现多样性，而成纤维细胞在黏附培养中形态较为统一。采用RNA测序分析了从肿瘤和对应的癌旁组织中建立的成纤维细胞，显示CAFs的炎症和收缩特征以及正常成纤维细胞的细胞生长和翻译特征上调，表明CAFs典型特征在体外可以维持。

同时，使用组织微阵列（TMA）对原始肿瘤组织在分子和组织学水平上进行了分析；并采用全外显子组测序（WES）与对应的正常基因组DNA进行比较，鉴定了肿瘤和类器官的体细胞变异。一致性分析显示肿瘤与类器官有63%±19%的重叠，而缺乏正常基质的类器官的检测灵敏度更高。通过对比已知驱动突变、拷贝数变异（CNV）等测试结果，证实建立的CRC类器官-间质生物样本库的临床和遗传学特征。

研究者对原始肿瘤组织、PDOs和异种移植肿瘤进行了RNA测序，以评估肿瘤特异性基因在体外如何保持稳定表达。PCA分析显示CRC组织和对应的类器官之间有明显的聚类，总体上更加同质化。基因组变异分析显示，与原发肿瘤样本相比，类器官基质和炎症特征下调，增殖和代谢基因上调。为了模拟基质的影响，类器官被系统地移植到NSG小鼠体内。通过RNA测序对13个模型的肿瘤进行分析，然后对mRNA reads进行物种反卷积，以区分肿瘤(人)和基质(小鼠)的基因表达。在肿瘤间室中，异种移植增加了与临床组织的整体相似性，并部分恢复了PDOs中差异调控的基因特征。虽然使用CRC固有亚型（CRIS）进行分类应该对基质基因表达不太敏感，但与原始肿瘤分型高度的一致性仅在移植后才观察到。因此可见，PDOs在标准培养条件下会失去其原始亚型，但在基质环境下可以部分恢复。而本研究中分析的5例CMS4肿瘤没有恢复，其原因很可能是  由于在人类reads中缺乏成纤维细胞转录本。

为了探索癌细胞是否可以指导亚型特异性基质反应，研究者分别将来自CMS4和CMS2，具有高、低CAF含量的特征的类器官异种移植后，进行小鼠mRNA reads分析。CMS4-衍生肿瘤中成纤维细胞/肌肉相关基因的表达增加，CMS2-衍生肿瘤中炎症相关基因表达增加；移植的PDOs诱导了亚型特异性基质反应。对肿瘤组织进行组织微阵列（TMA）和免疫荧光染色分析，发现在CMS2肿瘤中肿瘤细胞百分比更高，从而导致肿瘤-间质比例显著升高；且与原始肿瘤相比，人E-Cadherin（肿瘤细胞）和小鼠Vimentin组织学模式相似。

基于上述研究结果，研究者推测类器官与CAF共培养有助于了解亚型的确定，特别是对于CMS。源自2例CMS2和2例CMS4肿瘤的荧光素酶/ GFP转基因类器官被构建，用于考察与自体、异体CAFs共培养的差异。在不同类器官体系之间观察到的特征差异在很大程度上与CAFs来源无关。基于transwell共培养后的转录响应分析发现，自体和异种共培养具有相似的整体转录效应。CAFs的存在即会引起极大的细胞和转录变化，这种变化很大程度上是由肿瘤细胞的反应性决定的。研究提示，PDOs条件培养基仅部分重现了连续共培养的效果，这表明细胞-细胞直接接触和/或相互信号传导影响培养效果。

研究进一步考察了CAFs共培养对PDOs表型的影响，比较研究发现在PDOs常规培养条件下，原发肿瘤组织具备的微环境诱导的基因表达（CMS4）和增殖相关特征（CMS2）基本丢失，而在生长因子减少和CAFs共同培养后，亚型特异性基因表达的逐步恢复，并且CMS4对共培养具有选择性响应。

综上所述，CRC个体化特征的体现强烈依赖于培养环境，并且富含生长因子的培养基会干扰亚型特异性的表达。研究结果也提示对于非免疫相关表型，在无法获得自体CAFs的情况下，可以使用异源CAFs或正常成纤维细胞。

为了探索CAFs的调节基质，本研究进行了药理学文库筛选，该文库包含186个活性化合物和106个阴性对照化合物。研究者对两例（O14和O23）PDOs-CAFs共培养体系进行了分析，显示其对吉非替尼和SN-38的抗性异常增加。通过筛选，MET抑制剂（BAY-474）被确定为吉非替尼的最佳增敏剂。耐药共培养的剂量调整证实，与MET抑制剂BAY-474联合应用会显著增加吉非替尼的敏感性，并且BAY-474直接作用于肿瘤细胞，而非CAFs。总之，本研究强调CAFs通过一般机制导致治疗的耐药性，但也存在患者和治疗依赖的方式。因此，类器官基质模型提供了一种很有前途的、开发个性化治疗策略的转化工具。

最后，研究者对原始肿瘤组织、PDOs和CAFs共培养PDOs的转录组特征与药物反应的相关性进行了分析，以评估类器官-基质模型中不同的药物响应是否与结直肠癌患者预后相关。单一药物的敏感性特征与风险比（HR）的改变无关，而基于CAF药物影响的敏感基因表达识别患者无复发生存率（RFS）显著提高，表明与单独培养PDOs相比，PDOs-基质模型的药物测试展示出预后分级潜力。此外，基质药物特征可以进一步对临床患者的预后结果进行分级，高表达的敏感性和耐药特征分别表明CMS4患者的预后显著增加或恶化，而其他亚型的差异较小。相较于传统基于表达的分级方法，本研究结果提示，在共培养条件下的功能特征可以提供额外的预后价值。

原文索引：

[1] Farin HF, Mosa MH, Ndreshkjana B, et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discovery, July 25 2023. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-23-0050

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