罗国安教授团队在类器官芯片技术方面的系列工作之二—— 集成三维动态多细胞肝脏芯片的设计与制造及其在肝毒性筛选中的应用- 大数跨境

罗国安教授团队在类器官芯片技术方面的系列工作之二—— 集成三维动态多细胞肝脏芯片的设计与制造及其在肝毒性筛选中的应用

弘瑞医疗

2023-10-13

文献解读

罗国安教授团队在类器官芯片技术方面的系列工作之二——集成三维动态多细胞肝脏芯片的设计与制造及其在肝毒性筛选中的应用

肝脏是人体的主要代谢器官，不仅对营养物质的代谢起应答作用，调节血容量，支持免疫系统，控制内分泌和许多信号通路，维持脂质和胆固醇的稳态，还对外来化合物特别是药物进行代谢。传统的肝毒性研究是基于模型动物或体外培养的肝细胞系进行的，虽然可以在一定程度上概括适当刺激后的应激反应、信号通信或代谢途径，但常用的模型动物如啮齿动物、兔子、狗和猴子与人类的遗传差异不可忽视。人类来源的细胞，包括来自人体组织的原代细胞和许多永生细胞系，在毒性筛选中最大限度地减少了遗传差异。培养方法也分为静态或动态、二维（2D）或三维（3D）、单培养或共培养。除了传统的基于培养皿或配样品的单层2D培养外，2D微结构培养也是重构体外肝组织模型的常用方式，但因其通量较低，不适合毒性筛选研究，同时肝细胞功能也会在几天内会迅速下降。3D肝组织模型在保持肝细胞功能方面表现出更好的活性，特别是在非实质细胞（NPCs）与肝细胞共培养时。然而，尽管这种共培养比2D条件允许更复杂的细胞间通信，但流体剪切的影响仍然被忽略，这对于再现真实的生理微环境和维持特定的肝细胞功能非常重要。

近年来，已经开发出很多液体灌注培养细胞的装置，这些装置实现了不同生理流的再现，这些生理流的存在可以显著改变肝脏代谢特性，包括氧梯度的产生、代谢物和废物的排泄、营养物质的供应和剪切应力，这些都对肝细胞的功能和应激反应至关重要。但上述装置仍存在不足之处，如仅能培养肝细胞、需要大量的肝细胞和相应的培养基、需要较长的准备时间（通常>12天）才能达到肝细胞部分功能的重现。综上所述，现有的大多数模型无法再现体内肝脏组织的真实生理环境，这导致许多化学物质和候选物尽管通过了临床前安全性评估，但在后期仍会导致不可预测的肝毒性。

为了解决以上问题，罗国安教授团队开发了一种仿生可逆组装的肝芯片（liver-on-a-chip，3D-LOC）平台，该平台可实现3D HepG2/C3A细胞球的长期灌注培养，建立三维肝脏细胞球模型。该装置具有良好的生物适用性和良好的生理功能，较好地满足了预期的设计理念。然而，为了保证装置的密封性和可逆组装，每个细胞培养单元有10多个组件，这意味着6个单元的整个装置需要大约80个组件，这给后续实验的组装和使用带来了一些困难。并且，为了实现肝细胞与NPCs的共培养，团队在3D-LOC平台基础上进一步开发了一种三维动态多细胞肝脏芯片装置（3D-DMLoC），以更相似地再现肝脏微环境和功能因子表达水平。相关研究成果2022年发表于《Talanta》杂志上，题为“Design and fabrication of an integrated 3D dynamic multicellular liver-on-a-chip and its application in hepatotoxicity screening”（集成三维动态多细胞肝脏芯片的设计与制造及其在肝毒性筛选中的应用）。

主要研究结果

3D-DMLoC系统的设计与制作

本研究设计了一种在动态三维条件下内皮细胞与肝细胞共培养的简便、快速、可重复的方法，使肝细胞能够聚集形成球状肝组织而不是单层生长。根据设计，制作了如图1E所示的微孔阵列生成模具，然后对微孔阵列进行如图1F所示的成型，该模具可以制作出均匀性高的阵列。用10倍物镜观察单孔的尺寸，孔的实际直径接近900 μm，证明该模具较好地满足了设计要求。阵列凹微孔的设计可以保证足够的球体大小和细胞总量，用于后续的免疫荧光成像、蛋白检测或其他此类实验。

肝组织由实质细胞（肝细胞，约占总细胞总数的60%）和复杂的NPCs（约占40%）组成，NPCs与肝细胞共培养在多项研究中显示出了优势。本研究采用人源HepaRG细胞作为肝细胞模型，在类似研究中应用广泛，其功能因子的表达相对全面，包括肝细胞膜受体、I期代谢酶CYP4500s、肝功能因子ALB、尿素和一些转运蛋白，与HepG2、Hep3B、Huh7等其他肝细胞系相比，可以为体外肝毒性研究提供更可靠的肝脏模型。考虑到肝毒性研究的需要，研究者开发了一种排列良好的内皮细胞层来承受给药灌注，这种内皮细胞层不直接与肝细胞接触。在本研究中，适量的HUVEC被引入上层单元，自然生长成密集但不完全聚集的单层，以支持实时流体灌注，并负责与肝细胞球体交换营养物质、化学物质、代谢物和废物。

图1 3D-DMLoC系统设计图

3D-DMLoC的生物学适用性

2.1 基于COMSOL多物理场的有限元分析

采用COMSOL Multiphysics软件建立3D-DMLoC中功能单元（每个微孔）的有限元模型，首先设置灌注速度范围为1 ~ 100μL/min，然后分别模拟和分析肝细胞球体周围的流体流线、压力和氧浓度。图2A所示为上流道的速度大小和流线，证明注入上流道的流体能够均匀地向阵列上方流动。图2B展示了流速大小和下层液体通道流线，表明液体可以通过膜流向肝细胞球体的外周，这种流动有助于输送新鲜营养物质和清除球体周围的代谢废物。从图2C和2D的结果可以看出，流体通道内或球体周围的压力是均匀的，适合于细胞的生长，保证细胞不会因为压力差而形成不规则形状和发育混乱。由于PDMS具有良好的透气性，且芯片尺寸合适，1μL/min的灌注已足以为球体周围提供足够的氧气。氧浓度随流速从1~100μL/min的升高而逐渐升高，但当流速超过20μL/min时，上升速率变得非常低。同时，随着流速的升高，肝细胞球体周围的压力也在增加，可能发生潜在的细胞损伤，导致细胞应激反应发生不可预测的变化，而这种压力与生理环境有很大的不同。因此，虽然流速设置得越快，可以为肝细胞提供越多的营养和氧气，但这意味着细胞长时间培养将需要大量培养基，也会导致细胞分泌的信号被过度稀释，因此在后续实验中最终设置了20μL/min的流速，上下通道的氧浓度如图2E和F所示。

图2 有限元模拟结果

2.2 3D-DMLoC与静态培养球体的生长差异

如图3A-C所示，0.5h后肝细胞基本聚集在微孔中心，12h后基本形成球状，48h后形成圆球体。培养7天后冲洗出球体，用DAPI染色细胞核，观察球体大小和球体内腔。对图3D和E中x、y、z轴球体的中心重建显示，动态培养的球体的空洞明显小于静态条件下的空洞，说明3D-DMLoc可以为球体中心提供足够的营养和氧气，使细胞生长成更圆、更致密的球体。而在静态培养条件下，细胞倾向于向外生长，以获得足够的营养和氧气，从而导致细胞尺寸比动态情况下大。进一步结合PI染色标记晚期凋亡细胞和坏死细胞，动态培养时球体内只有少量细胞被PI染色，坏死比例极低，而静态球体内大量细胞被染色，坏死比例较高，如图3F和G所示。综上所述，3D-DMLoc在共培养肝细胞方面具有生物学适用性。

图3 肝细胞生长状况

不同培养条件下的肝功能

3.1 肝极化重建

肝脏极化是肝脏发挥代谢和转运功能的重要基础，也是评价体外肝脏模型适用性的重要指标。多药耐药蛋白2（MRP2）是一种功能性蛋白，通常位于相邻细胞之间的小管间隙中，负责偶联胆汁盐和胆红素的排泄。紧密连接蛋白-1（Occludens Protein-1，ZO-1），也称为小带蛋白，是位于细胞-细胞接触部位的紧密连接和粘附连接的膜相关成分。这些蛋白染色可以识别小管间隙的位置，观察细胞-细胞连接的紧密程度，评价胆管样结构的形成程度。如图4所示，MRP2和ZO-1在3D-DMLoC中的荧光分布比在静态3D中更宽、更轻，表明细胞生长良好，重建肝脏极化更好。MRP2在球体内部高度表达，在不同区域聚集形成一定的连接。而在静态球体中，虽然ZO-1的表达也相对较高，但MRP2的表达较为稀疏和分散分布，明显低于3D-DMLoC。此外，细胞核染色图显示静态球体中有较大的空腔，动态球体中没有明显的空腔，也证明动态培养的球体可以获得更多的营养来维持细胞的生长。

图4 3D-DMLoC与静态3D之间MRP-2和ZO-1表达的差异

3.2 不同培养条件下CYP450、ALB和尿素的表达

CYP450是外源物质代谢的重要肝脏酶，它能使电子通过非共价键与血红素中的铁离子结合，氧化并增强外源生物的水溶性，使其更容易被排出体外。本研究采用Western blot法检测细胞色素CYP1A2、2B6、2C9、2C19、3A4、P450还原酶的表达，结果如图5A所示。将各自的值与动态3D得到的值进行比较，计算相对表达率，如图5B所示。其中，1A2和2C9在动态3D明显高于静态3D和2D，3A4和P450还原酶表达稍弱，但趋势与1A2和2C9相似。2B6在静态3D培养中的表达量略高于动态3D和2D，但与3D动态条件下无显著差异。本研究未检测到2C19。如图5C所示，动态3D培养72h后ALB和尿素的表达水平高于静态3D和2D，说明动态3D培养的肝细胞具有更好的肝功能。综上所述，相比传统细胞培养方式，3D-DMLoC培养干细胞球具有更好、更全面的肝功能，可为肝脏研究提供更可靠的体外肝组织模型。

图5 肝功能因子表达与药物、重金属所致肝毒性

基于动态3D和静态2D的肝毒性敏感性差异

当细胞受损时，细胞内乳酸脱氢酶（LDH）会通过渗透膜流到细胞外。因此，通过测定乳酸脱氢酶的释放量可以在一定程度上评价损伤程度。给药后，基于LDL的相对细胞活力如图5D和5E所示。顺式-二氯二胺铂(II)、对乙酰氨基酚、环孢素和丝裂霉素C表现出较强的肝毒性，动态3D细胞活力大多低于同剂量处理2D组，其中对乙酰氨基酚的作用最显著。重金属离子在2D和动态3D培养中均产生一定的肝细胞毒性，且在设定剂量范围内均表现出剂量毒性相关性。3D实验中Cu、As和Cd的IC50分别为2.215ppm、1.337ppm和1.256ppm，2D实验中Cu、As和Cd的IC50分别为8.112ppm、1.181ppm和1.632ppm。两种培养条件下As的IC50相似，另外两种离子在动态3D环境下毒性更大。联合离子组的结果显示，联合可导致更大的肝毒性，表明不同离子的毒性作用机制不同。进一步检测各组动态3D培养上清液中ALT和AST的含量，如图5F和5G所示。与对照组相比，几乎所有组ALT的表达均升高，而几乎所有组AST的表达均降低。将各实验组动态3D中ALT和AST的相对表达量与对照组对应值进行比较，几乎所有的ALT/ALT比值均小于1，按照临床指标评价标准，提示发生了急性肝损伤，其中顺式-二氯二胺铂(II)、环孢素、丝裂霉素C、As、Cu及混合离子组急性损伤更严重，诱发肝毒性的概率更高。综上所述，相较于传统培养方式，3D-DMLoC培养肝细胞球对外源性或内在化学物质引起的肝毒性反应更为敏感。

研究结论

该研究基于微流控技术成功研制了一种具有良好生物适应性和肝脏功能重现的内皮细胞-肝细胞共培养装置，该装置易于高效批量生产和组装，也易于准确地用于体外筛选和评价各种化学物质引起的肝毒性。基于3D-DMLoC研究了几种临床药物和重金属离子的毒性作用，发现上述化学物质可导致肝细胞急性损伤，并且3D-DMLoC损伤更严重，这意味着细胞对刺激的反应比传统的静态3D或2D培养更敏感。未来，该方法可用于简便、高效、准确地筛选潜在的肝毒性化学物质。

原文索引：

[1] Zheng YB, Ma LD, Wu JL, et al. Design and fabrication of an integrated 3D dynamic multicellular liver-on-a-chip and its application in hepatotoxicity screening[J]. Talanta, 2022, Volume: 241. DOI: 10.1016/j.talanta.2022.123262