研究背景
水稻是我国重要的粮食作物，穗粒数是决定产量的关键因素之一。细胞分裂素可正向调控花序分生组织活性，而其降解酶OsCKX2/Gn1a负调控穗粒数，DEP1则正向调控穗粒数（GNP）。然而，DEP1与OsCKX2之间的调控机制尚不明确。
文章介绍
2024年12月11日，中国农科院作科所万建民院士团队在The Plant Cell在线发表题为“The DENSE AND ERECT PANICLE1-GRAIN NUMBER ASSOCIATED module enhances rice yield by repressing CYTOKININ OXIDASE 2 expression”的研究论文。该研究克隆了水稻穗粒数关键基因GNA，揭示了其通过与DEP1互作调控OsCKX2表达、影响细胞分裂素积累进而提升产量的分子机制。
主要研究技术
图位克隆、RT-qPCR、载体构建与遗传转化、亚细胞定位、BiFC、RNA原位杂交、酵母双杂交、LUC互补成像、Co-IP、ChIP-qPCR、酵母单杂交、蛋白诱导纯化、EMSA、LUC活性测定、Western blot等。
核心发现
gna突变体表型分析
研究发现一个源自粳稻Kitaake的自发隐性突变体gna，表现为半矮化、株型致密、分蘖减少、穗短且一二级分支减少，导致籽粒数显著下降，单株产量降低55%。尽管籽粒变宽增重，但总体产量仍明显下降（图1）。
图1 gna突变体的表型特征
GNA基因的图位克隆与功能验证
通过gna与IRAT129杂交F2群体进行图位克隆，将GNA定位于3号染色体74 kb区间内，包含10个ORF。RT-qPCR和测序分析确定ORF7（LOC_Os03g51330）为候选基因，其起始密码子附近存在64 bp缺失。利用CRISPR/Cas9和RNAi敲除该基因后，转基因植株重现gna表型；互补实验恢复野生型表型，证实GNA即为ORF7（图2）。
图2 GNA的图位克隆
GNA表达模式及过表达效应
GNA在根、茎、叶、叶鞘中广泛表达，在幼穗原基中表达最高，亚细胞定位于细胞核和内质网。过表达GNA显著增加株高、穗长、一级和二级枝梗数、每穗粒数及单株产量，而对分蘖数和千粒重无显著影响，表明其主要通过增加穗粒数提升产量。在NIP、ZH11和NG3等多个遗传背景下过表达GNA均能显著增产，但增益效果受原始穗长限制——穗越长，增粒幅度越小（图3）。
图3 过表达GNA的转基因植物表型
GNA与DEP1相互作用并位于其下游
酵母双杂交筛选发现GNA与DEP1蛋白直接互作，LUC互补和Co-IP实验进一步验证该相互作用。在dep1功能获得突变体中也检测到相同互作，说明GNA对DEP1功能执行至关重要。通过构建DEP1cri和双突变体gna/DEP1cri，发现双突变体表型与gna高度相似，表明DEP1位于GNA上游（图4）。
图4 GNA与DEP1相互作用并在DEP1下游起作用
OsCKX2是GNA的直接靶基因
基于已知dep1中OsCKX2表达下调，推测其可能受GNA调控。ChIP-seq和酵母单杂交实验证实GNA可直接结合OsCKX2启动子区域（P2/F2和P5/F6片段），双LUC实验进一步验证该抑制作用。过表达GNA显著降低OsCKX2的mRNA和蛋白水平。遗传分析显示，gna与OsCKX2cri双突变体表型与OsCKX2cri单突变体相近，表明OsCKX2位于GNA下游并作为其关键靶点（图5）。
OsCKX2为细胞分裂素氧化酶，其表达下降导致活性细胞分裂素（如iPR、iP、tZ等）在花序中积累，同时上调A型应答因子OsRRs表达，从而促进分枝发育和穗粒数增加。
图5 OsCKX2是GNA的直接下游靶基因
DEP1增强GNA对OsCKX2的抑制作用
报告基因实验显示，GNA单独可抑制OsCKX2启动子活性，当与DEP1或dep1共表达时抑制效果更强，且两者增强能力相当。在gna、DEP1cri及双突变体中，OsCKX2表达依次升高，尤其在双突变体中显著上升。在NIL-dep1材料中，GNA表达高于NIL-DEP1，而OsCKX2表达更低，说明DEP1通过促进GNA功能间接强化对OsCKX2的抑制（图6）。
单倍型分析显示，GNA（hap1,2,4）、DEP1（hap2）和OsCKX2（hap1,3,5）的优异单倍型均与更高穗粒数相关。组合单倍型（CH1）整合三者优势，在地方种和改良品种中均罕见，具有重要育种潜力。
图6 DEP1增强GNA对OsCKX2的转录抑制，并关联多种单倍型
GNA促进DEP1核转位
DEP1为膜定位蛋白，其如何进入细胞核长期未解。BiFC和原生质体定位实验表明：在gna突变体中，DEP1仅定位于细胞膜；在野生型中分布于膜、质、核；而在GNAOE中核定位显著增强。统计显示，DEP1在gna、WT和GNAOE背景下的核定位阳性率分别为1.2%、23.5%和71.4%。相反，功能获得型dep1无论背景如何均稳定定位于核内。结果证明GNA介导DEP1核转运，而dep1自身具备自主入核能力，可能是其强效抑制OsCKX2的原因之一（图7）。
图7 GNA促进DEP1核转位
研究结论
本研究鉴定了水稻粒数调控新基因GNA，阐明其编码蛋白与DEP1互作，形成“DEP1-GNA-OsCKX2”调控模块：DEP1通过与GNA结合促进后者功能，GNA直接抑制OsCKX2表达，导致细胞分裂素在花序中积累，从而增加穗分支数和粒数，最终提高产量。同时揭示GNA是DEP1核转位的关键辅助因子，而dep1突变体可独立入核，解释其强效增产机制。该模块在多个遗传背景下均具增产潜力，优异组合单倍型CH1为未来高产育种提供了重要资源。