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基于代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠机体代谢调节规律

食品工业科技编辑部

2021-07-06

基于代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠机体代谢调节规律

——遵义医科大学张建永副教授

研究背景

凤冈锌硒茶，产自贵州省凤冈县，为典型的富锌富硒茶。有学者测定了凤冈县田坝仙人岭公司的几个茶场中凤冈锌硒茶茶叶锌的含量，锌含量最高为82.84 mg/kg，最低为25.66 mg/kg。近年来针对凤冈锌硒茶的生物活性开展了许多研究，研究发现凤冈锌硒茶能明显增加衰老模型小鼠血清Trx（硫氧化还原蛋白）含量，具有延缓衰老的作用。此外还有降脂、肝损伤保护、抑制肿瘤细胞生长等作用，以上研究多是从疾病模型入手，而茶作为我国的一种常用饮品，多在机体正常时候饮用，通过整体调节发挥效应，然而目前关于凤冈锌硒茶对正常机体的整体代谢调节作用的研究有限。

代谢组学是研究生物体在受到外源性刺激后，其内源性代谢物种类、数量及其变化规律的科学。其整体性的优势和特点，为复杂物质基础的深入研究提供了新的手段，同时还可通过借鉴国际通行的医药标准研究规范来研究生命体的规律，从而去认识疾病的本质以及阐明药品食品等的功效、作用机理等。近年来，许多学者基于代谢组学对茶做出了大量的研究。如刘建等基于1H-NMR的代谢组学技术探讨了普洱茶茶褐素对高脂大鼠的降血脂机制，筛选出缬氨酸等6种标志代谢物，揭示其机制可能与氨基酸代谢、能量代谢等代谢途径有关，而Xiang等基于代谢组学研究发现藤茶可通过Akt信号通路改善2型糖尿病大鼠的葡萄糖和脂质代谢紊乱。

气质联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）在化学、生物和环境分析中已经得到广泛的应用，因其具有高效、可重复性、高灵敏度和代谢物易鉴定等技术优势，常作为代谢组学研究的可靠平台。因此张建永团队基于GC-MS代谢组学技术筛选出凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的关键代谢物，进一步通过通路富集分析揭示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的通路，从而初步揭示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的作用机制。

1 肝脏组织形态学变化观察

图1为大鼠肝脏组织的病理HE切片图，可以明显看出凤冈锌硒茶高、低剂量组，与对照组的肝脏组织的形态学并无明显病理变化。

图1 大鼠肝脏病理形态学（× 400）

Fig 1 Morphological observation of liver pathologyin rats（×400）

注：A对照组；B凤冈锌硒茶低剂量组；C凤冈锌硒茶高剂量组。

2 血浆氧化酶应激状态结果

给茶后4周凤冈锌硒茶高、低剂量组的MDA含量和对照组相比显著下降（P<0.05），SOD活性各组间无显著差异。

3 代谢组学分析

3.1 GCMS代谢组学分析

将各组大鼠血浆样品前处理后进行GC-MS分析，得到总离子流图，如图2所示，共鉴定出26个代谢物。

3.2多元统计分析

3.2.1PCA分析

采用SIMCA-P 14.1对样本数据进行PCA分析，如图3所示，对照组与给茶组分离不明显，表明给茶后有变化，但是变化不明显。

3.2.2 OPLS-DA分析

为了更好的观察饮用凤冈锌硒茶对血浆代谢物的影响，本研究进一步通过构建OPLS-DA模型，如图4所示，模型的R2均大于0.5，如表2所示，说明模型的拟合准确性好。进一步对OPLS-DA模型进行200次置换验证，如图5所示，置换验证的R2与Q2均小于表2中模型的原始值，且Q2＜0。说明构建的OPLS-DA模型稳健。在模型未过拟合的基础上，可以看出对照组与高、低剂量组的代谢轮廓存在一定的差异。

4 差异代谢物的筛选

结合NIST标准库对总离子流图中的离子进行代谢物鉴定，共鉴定出匹配度≥80的代谢物25种，如表3所示。进一步通过SIMCA-P14.1进行分析，以变量重要性投影（VIP）>1及P<0.05，筛选出凤冈锌硒茶调节大鼠血浆的五种差异代谢物，分别为丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸。同时得到五种差异代谢物在各组中的相对含量。如图6所示，其中给茶高剂量组中的L-脯氨酸，肌醇，琥珀酸的含量较对照组明显下降（P<0.05），丁酸、硬脂酸的含量明显升高（P<0.05），低剂量组仅升高了丁酸的含量（P<0.05）。

表3 大鼠血浆样品GC-MS分析的代谢物鉴定结果

Table 3 The results of metaboliteidentification of GC-MS analysis of rat plasma

保留时间（min）	代谢物名称	匹配度	分子量	保留指数
8.725	丙酸	91	74	1115
9.083	丙氨酸	90	89	1745
9.083	肌氨酸	80	89	1745
10.534	糠酸	86	112	1106
11.304	丁酸	91	88	1109
14.088	L-亮氨酸	90	131	1125
14.845	甘氨酸	87	75	1130
15.006	琥珀酸	93	118	1131
16.218	丝氨酸	90	105	1140
16.821	L-苏氨酸	91	119	1145
17.02	戊二酸	87	132	1146
19.593	L-脯氨酸	97	115	1173
22.897	二十烷	90	282	1225
25.399	十四烷酸	97	228	1292
26.194	酪氨酸	93	181	1322
26.662	壬二酸	87	188	1343
26.861	D-葡萄糖	91	180	1353
28.151	吡喃葡萄糖	91	180	1433
28.151	岩藻糖	90	164	1433
28.632	十六烷酸	98	256	1473
29.819	肌醇	92	180	1612
30.12	十七烷酸	96	270	1661
31.127	9,12-十八碳二烯酸	87	280	1906
31.204	油酸	96	282	1933
31.596	硬脂酸	98	284	2095

5 代谢通路分析

对筛选出的5种差异代谢物经metaboanalyst通路富集分析，结果如图7所示，其中磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环的impact值大于0.02，提示凤冈锌硒茶影响大鼠机体代谢调节的作用机制与磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环密切相关。

6 讨论

凤冈锌硒茶茶叶中锌硒含量丰富，其中硒通常以硒代替胱氨酸的形式存在于氧化酶中，参与清除由人体内部新陈代谢产生的自由基。SOD是超氧化自由基的特异性清除酶，它能保护细胞免遭有氧代谢反应中产生的超氧离子的损伤，从而对机体起保护作用。MDA是脂质过氧化反应和脂质代谢产物之一，当机体内MDA升高，SOD降低时，提示肝脏可能受到损伤。本实验得到的结果显示给茶后4周凤冈锌硒茶高、低剂量组的MDA含量较对照组显著降低，而对照组SOD活性与凤冈锌硒茶高、低剂量组相比无明显变化，说明凤冈锌硒茶有一定的抗氧化作用，进一步表明饮茶后这种作用可能对肝脏具有一定的保护作用。这与文献报道的红茶对高脂饮食小鼠肝脏具有保护作用及绿茶提取物对四氯化碳致小鼠急性肝损伤具有护作用一致[17-18]，同时在病理形态学方面发现，饮茶对肝脏无明显损伤发现，也进一步证明了其具有良好的安全性。

在给茶后4周的大鼠血浆中的MDA含量发生变化后，本研究对此时间点的血浆样品进行代谢组学分析，经OPLS-DA分析，发现给茶后，大鼠血浆代谢轮廓发生了显著变化，并筛选出凤冈锌硒茶影响机体的五个差异代谢物，包括丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇、硬脂酸，涉及到机体的磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环，提示凤冈锌硒茶可能通过以上代谢物及途径发挥整体调节作用，为了更清晰的表征本作用，本研究整合上述差异代谢物及其关联的代谢通路，从网络角度揭示凤冈锌硒茶对大鼠机体的综合调节机制，如图8所示。

肌醇是人体细胞生长的一种必需物质，具有促进组织中脂肪代谢，降低血脂、参与体内新陈活动，具有促进细胞生长等[19-20]。有文献报道的衰老模型大鼠中肌醇含量出现升高，在给予琼玉膏干预后降低了衰老模型大鼠中升高的肌醇[21]，本研究结果显示在给予大鼠凤冈锌硒茶后体内肌醇含量较对照组明显的下降（P<0.05），肌醇含量的下降可能是凤冈锌硒茶作用后使其参与了抑制过氧化产物MDA的增加，这与文献报道肌醇具有抑制脂质过氧化，降低MDA含量一致。肌醇还可参与下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代谢等，进一步分析网络发现，下游通路脂肪酸生物合成、丁酸代谢中硬脂酸和丁酸含量显著升高，进一步印证了凤冈锌硒茶可能通过调节磷酸肌醇代谢中肌醇参与下游通路丁酸代谢，从而使大鼠机体内丁酸含量升高，促进大鼠机体的新陈代谢。此外体内丁酸含量升高会抑制肠腔肠上皮细胞增殖，并促进其凋亡，从而达到新陈代谢的目的，提示凤冈锌硒茶可能具有改善肠道菌群的作用。硬脂酸为长链脂肪酸，其具有一定的抗炎症和抗氧化应激作用，适量摄入可减轻胆汁阻塞引起的肝损伤，研究发现给茶后机体内硬脂酸含量升高，揭示凤冈锌硒茶通过影响脂肪酸代谢使硬脂酸参与抑制过氧化物MDA的增加。脯氨酸在机体应激状态胁迫下会升高，喝茶可能使机体处于更稳定状态，所以使得脯氨酸含量降低，从侧面来讲凤冈锌硒茶增强了机体的抗应激能力。琥珀酸是TCA的代谢产物，琥珀酸脱氢酶活性降低及基因突变可引起琥珀酸含量升高，促进肿瘤发生和发展，本研究发现凤冈锌硒茶可降低血浆中琥珀酸的含量，提示凤冈锌硒茶可能具有一定的防癌作用。

7 结论

基于GC-MS代谢组学技术研究凤冈锌硒茶对正常大鼠的整体代谢规律，筛选出了差异代谢物丁酸、L-脯氨酸、琥珀酸、肌醇和硬脂酸，初步揭示了凤冈锌硒茶通过磷酸肌醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、三羧酸循环等代谢途径影响大鼠机体代谢。为今后凤冈锌硒茶的进一步研究提供了一定的理论依据，此外还对凤冈锌硒茶新产品的开发具有重要意义。但本文属于非靶向代谢组学研究，研究得到的差异代谢物仍需进一步验证。

通信作者简介

张建永副教授

沈阳师范大学粮食学院

遵义医科大学药学院

张建永，学科方向带头人，男，辽宁人，硕士研究生导师，副教授，博士，毕业于中国中医科学院。药学院学科建设与研究生教育管理办公室负责人，资源昆虫产业国家创新联盟理事会副理事长，五倍子产业国家创新联盟理事会理事、贵州省科技进步奖大会评审专家、贵州省科技厅科研成果鉴定专家(中药类)、贵州省卫计委科研项目审评专家、世界中联网络药理学专业委员会理事。中国医师学会中西医结合医师分会基础与临床转换医学专业委员会常务委员。中国仪器仪表学会药物质量分析与过程控制分会理事。中国民族医药学会信息与大数据分会理事。贵州省教育厅科技拔尖人才。主要从事中药体内药物分析的研究工作。在研主持国家自然科学基金项目2项，贵州省科技重大专项1项，省科技厅项目2项，教育部春晖计划项目1项，贵州省中管局1项。发表论文20余篇，其中SCI收录8篇。先后获得遵义医科大学最美劳动者称号。为SCI杂志Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (eCAM)，Drug Design, Development and Therapy，Nutrition and Diabetes审稿人，中成药、现代医药卫生杂志审稿人。Asian Toxicology Research编委，2016年遵义医科大学最美劳动者。电子邮箱：zhangjianyong2006@126.com。

代表性著作：

[1] Jianyong Zhang, Qihong Chen, Le Wang, Kuan Chen, Wenbi Mu, Cancan Duan, Xiaofei Li. Study on the mechanism of cantharidin-induced hepatotoxicity in rat using serum and liver metabolomics combined with conventional pathology methods[J]. Journal of Applied Toxicology, 2020: 1-13.

[2] Jianyong Zhang, Rixin Liang, Lan Wang, Bin Yang*. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2019, 229: 104-114.

[3] Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu, Xiao-Fei Li*. HPLC Fingerprinting and Spectrum-antitumor Effect Relationship for Discrimination between Mylabris phalerata Pallas and Mylabris cichorii Linnaeus[J]. TMR Modern Herbal Medicine, 2018, 1(1): 11-18.