​长春工业大学王志兵副教授等|涡旋辅助离子液体双水相萃取五味子中木脂素类化合物

[C₄mim]BF₄与MgSO₄和Na₂CO₃形成的相图如图2所示，双节线下方的区域为均匀的单相，形成双水相的两组分混合后溶液澄清，为均相区；双节线上方的区域，不同的两组分混合后体系能自动分为两相，为双水相区；双节线上的部分，溶液刚好由澄清变为混浊，为刚要分相的区域。[C₄mim]BF₄/MgSO₄双水相的成相范围为：[C₄mim]BF₄21.28%~78.43%，MgSO₄ 5.88%~37.70%，水15.69%~45.38%。[C₄mim]BF₄/Na₂CO₃双水相的成相范围为：[C₄mim]BF₄ 22.10%~83.33%，Na₂CO₃ 4.17%~30.39%，水12.50%~50.71%。

图2显示了[C₄mim]BF₄与MgSO₄和Na₂CO₃体系在298 K下测定的二项式曲线，该曲线提供了有关形成双相体系的各相组分浓度的信息。从图中可以看出，向离子液体的水溶液中加入正确浓度的MgSO₄或Na₂CO₃，形成了ATPs。众所周知，二项式曲线越接近原点，成相能力越强。通过绘制[C₄mim]BF₄/MgSO₄和[C₄mim]BF₄/Na₂CO₃的相图发现[C₄mim]BF₄/Na₂CO₃的成相能力优于前者，但试验结果表明[C₄mim]BF₄/MgSO₄体系对木脂素类化合物的提取量更高。这表明对于双水相体系组成的选择，成相能力不是第一评价标准。

离子液体/盐双水相由离子液体、盐和水三部分组成，在本研究中，离子液体作为萃取溶剂，其结构和理化性质对双水相成相和萃取效果有重要影响。因此，本研究考察了4种离子液体[C₂mim]BF₄、[C₄mim]BF₄、[C₆mim]BF₄和[C₈mim]BF₄对目标物回收率的影响。实验结果表明，[C₂mim]BF₄和[C₈mim]BF₄不能形成双水相体系，其主要原因是[C₂mim]BF4有较强水溶性，加盐后始终为均相溶液，而[C₈mim]BF₄由于其较强的疏水性，加入到水溶液时不溶，直接沉于试管底部。[C₄mim]BF4和[C₆mim]BF₄可与盐形成双水相体系，且[C₄mim]BF₄形成的双水相效果最好。据文献报道，离子液体咪唑环上的烷基链越长，其疏水性越强，对水的斥力越大，形成双水相的能力就越强。虽然[C₆mim]BF₄疏水性强于[C₄mim]BF₄，疏水性增强，但黏性也更强，不利用双水相萃取。因此，本研究选用[C₄mim]BF₄进行后续的实验。

本研究考察了当水为4mL，MgSO4用量为1.6 g时，离子液体用量（250~550 μL）对木脂素类化合物提取量的影响。如图3所示，随着离子液体用量从250 μL增加至500 μL，木脂素类化合物的提取量明显提高，五味子醇甲提取量由3.42 mg·g⁻¹提高至5.26 mg·g⁻¹，各化合物提取量提高近50%。然而，继续增加离子液体用量，目标物提取量几乎不变或略有下降。这可能是由于离子液体具有一定粘度，其用量增加，尽管能有效提取目标物，但同时也增加了体系的粘度，不利于传质。因此，本研究选择离子液体用量为500 μL。

2.2  盐的种类及用量

无机盐的加入会影响离子液体在双水相体系中的分布，同时也会改变目标组分的分配系数和提取效率。因此，本研究考察了[C₄mim]BF₄分别与硫酸镁、碳酸钾、碳酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾和氯化钠的成相效果。实验结果表明，当水为4mL，离子液体体积为500 μL时，MgSO₄和Na₂CO₃可以与[C₄mim]BF₄形成双水相，这可能是因为偏渗透性离子CO₃²⁻、SO₄²⁻与水分子的相互作用更强，有利于双水相的形成。如图4所示，MgSO4所形成的双水相体系的提取量明显高于Na₂CO₃，这可能是因为Mg²⁺的原子半径更大，电荷也更高，导致了这种现象的发生。因此，本研究选用MgSO₄作为成相盐。

此外，本研究还考察了MgSO₄用量为1.1~1.7g时对目标物提取量的影响。如图5所示，随盐用量的增加，离子液体相体积不断增加，目标物提取量随之增加，这可能是因为随着盐用量的增加，MgSO₄的盐析作用占主导地位，IL逐渐与水分离且目标物随着IL相富集到上相。当MgSO₄用量为1.6g时，提取量最高，此时上相（IL相）体积为450 μL，继续增加盐的用量，目标物提取量略有下降，这可能是因为成相盐的过量使用使粘度增加，不利于目标分析物的转移，从而导致提取量降低。因此，本研究选择MgSO₄的用量为1.6g。

2.3  涡旋时间

在萃取时，涡旋可以加速乳状液的形成，增加萃取剂与目标物质的接触面积，加速传质并缩短萃取平衡时间。本研究考察了涡旋时间（0.5~5min）对五味子中木脂素类化合物提取量的影响。实验结果如图6所示，在涡旋1.5min时提取量最高，总木脂素类化合物提取量为9.82 mg·g⁻¹，尽管涡旋时间对目标物提取量影响较小，但如不对样品溶液进行涡旋时，[C₄mim]BF₄/MgSO₄体系分相耗时长。然而，在对该体系进行涡旋后无需静置，即可分相。为了加速传质过程，缩短提取时间，本研究选择涡旋1.5min作为后续实验条件。

2.4  离心转速及时间

离心能促进双水相体系的形成，使相与相之间的分层更加清晰，便于离子液体相的转移。因此，本研究考察了1000~5000 r·min⁻¹范围内离心转速对目标物提取量的影响。如图7所示，随着离心转速的增加，木脂素类化合物的提取量逐渐提高，当离心转速为3000 r·min⁻¹时，提取量达到最大值。

此外，本研究还考察了不同离心时间（2~30min）对提取量的影响。如图8所示，在离心10 min后，双水相分层清晰且木脂素类化合物的提取量达到最大值，体系达到萃取平衡，提取量不再上升。在离心之后，目标物被富集于上相，下相为水相，中间相为五味子残渣。此时相界面清晰，便于上相全部取出。因此，本研究选择在3000r/min，离心10 min为最佳离心条件。

配制含有7种木脂素类化合物的一系列浓度的混合标准品溶液，以目标物质的浓度（c）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线。检出限（LOD）和定量限（LOQ）为信噪比（S/N）分别为3和10时仪器能检出和定量目标物质的最低浓度。日内、日间精密度以相对标准偏差（RSD）表示，在最佳实验条件下，一天内连续分析6次样品所得的目标物提取量的RSD为日内精密度；每天分析2次、连续分析3d样品所得目标物提取量的RSD为日间精密度。实验结果如表1所示，各目标分析物在线性范围内具有良好的线性关系（r>0.9995），LOD和LOQ分别为0.20~6.98和0.65~23.26 ng·mL⁻¹，日内精密度RSD低于3.97%，日间精密度RSD低于4.19%，方法性能满足要求。

为了确定本研究的准确性和适用性，本研究分别进行了加标回收率与实际样品分析试验。加标回收率如表2所示，各目标物质的回收率为72.22%~97.19%，RSD低于3.97%，实验结果令人满意，因此本研究建立的方法可用于其他中药中木脂素类化合物的提取。

本研究对7种不同产地的五味子样品进行分析，分别来自辽宁（样品1）、浙江（样品2）、黑龙江（样品3）、陕西（样品4）、甘肃（样品5）、内蒙古（样品6）和吉林（样品7）。实验结果如表3所示，所有产地北五味子样品中，各目标分析物中均以五味子醇甲的含量最高，是中药五味子的标志性成分，这与中国药典的报道相一致。从表3可以看出，五味子醇甲的含量为0.08~5.33 mg·g⁻¹，戈米辛D的含量为0.04~0.34 mg·g⁻¹，五味子醇乙的含量为0.07~1.98 mg·g⁻¹，五味子酚的含量为0.12~0.91 mg·g⁻¹，五味子甲素的含量为0.30~1.07 mg·g⁻¹，五味子乙素的含量为0.05~1.47 mg·g⁻¹，五味子丙素的含量为0.03~0.18 mg·g⁻¹。各产地的五味子中木脂素类化合物的含量不同，原因可能是各地药材的生长环境、光照条件、雨水条件及采收时间均不同。东北五味子的五味子醇甲的含量明显高于其他产地，与其他文献中报道的一致，亦与中药道地药材的标准一致。五味子标准溶液与样品提取物色谱图如图9所示。

为了评价本研究所建立的方法的实用性，将其与超声提取法、热回流法进行比较，实验结果如表4所示。与其他方法相比，本法无需过滤、浓缩等步骤，简化了操作流程。与热回流相比，本法将提取时间从120min缩短至12min，大大减少了实验时间，且不用加热，操作简单。综上所述，本法具有操作简单、用时短、提取量高等优点。