《食品工业科技》客座主编专栏：佛山科学技术学院郭嘉亮教授|天然产物中抗微生物肽的高效筛选方法及研究进展

面对耐药病原体的挑战，天然抗微生物肽（Antimicrobial peptide，AMP）成为了开发新一代抗菌候选药物的重要来源之一，在食品、农业等领域同样有着广泛的应用。然而，从天然产物中快速筛选获得抗微生物肽仍然存在着低效、高耗等种种困难与挑战。本文首先介绍了抗微生物肽的作用机制（包括膜作用机制与非膜作用机制）；然后重点综述了AMP的高效筛选方法，包括整体细菌吸附结合法、细胞膜色谱法、磷脂膜色谱法、毛细管电泳法、比色法、薄层色谱法、荧光筛选法、高通量测序法和数据库挖掘法等；此外，展望了高效发掘抗微生物肽的发展方向。本论文为从纷繁复杂的天然产物体系中发现抗微生物肽提供了可参考的科学依据。

天然AMP来源于生物体的不同部位，样品复杂、多样，如何快速锁定和获得AMP成分是目前的难点问题。当今，AMP的筛选普遍采用“抗生素之父”瓦克斯曼开发的经典方法（Waksman’s approach）进行筛选[32]，即将制备好的粗肽经逐级、反复柱色谱分离纯化，结合抗菌实验得到纯化的单一AMP。此法依循“活性制导分离”（Bioassay-guided fractionation，BGF）策略，以整体活性为导向，先分离、后鉴定、再逐一评价。该过程线性分析通量低、单次检测信息量有限，导致工作量大、效率低、成本高、周期长，容易造成微量活性成分丢失，且肽的活性在冗长的分离过程中必然受到影响。显然，传统筛选方法在分析通量、分析效率、分析内涵上均存在重大缺陷，严重制约了从天然产物复杂体系中筛选发现AMP成分。近年，涌现出多种新型的AMP筛选方法，包括整体细菌吸附结合法、细胞膜色谱法、磷脂膜色谱法、毛细管电泳法、比色法（上述基于膜作用机制为主），以及薄层色谱法、荧光筛选法、高通量测序法以及数据库挖掘法等（基于非膜作用机制为主），其应用比较如表1所示。通过综合利用多种与抗菌活性相关的理化参数或结构参数对肽进行分级筛选，再对得到的多肽序列进行评估分析，最终获得所需的AMP。

整体细菌吸附结合法（Bacterial adsorption）是利用AMP与细菌细胞膜通过静电作用，对比整体细菌混合孵育前后所得液相色谱差异峰，获得潜在AMP成分所在色谱峰位置以此筛选出所需AMP。Pei等利用黄油加工后的副产品废牦牛奶，将其旋转蒸发浓缩再添加相应的酶进行水解，与水热法制备的纳米磁性脂质体结合，在37 ℃下孵育24 h，经分离纯化，测定吸光度并比较峰值，筛选出两种抗菌肽并确定其氨基酸序列，即Arg-Val-Met-Phe-Lys-Trp-Ala和Lys-Val-Ile-Ser-Met-Ile。Pei等用同样的方法将磁性脂质体吸附与反相高效液相色谱相结合，从大鲵的血液中筛选出新的抗菌肽，通过N末端测序确定氨基酸序列，为Gly-Leu-Thr-ArgLeu-Phe-Ser-Val-Ile-Lys，将其命名为 andricin B。该方法与传统方法相比，操作简便，大幅缩短了筛选时间，具有很好的开发应用价值。然而，活体细菌可能会吸附粗肽中其他蛋白成分，导致筛选准确性降低，加大后续分离难度。

细胞膜色谱法（Cell membrane chromatography，CMC）是将细胞膜结合到硅胶表面，制成细胞膜固定相，再利用色谱学技术研究药物与受体之间的相互作用规律的方法。AMP与细胞膜发生相互作用，使其在色谱上保留增强，从而快速将AMP成分从复杂体系中分离出来。Xiao等[35]使用小鼠心房细胞膜制备的细胞膜亲和层析柱成功地从麻风树粕蛋白粉（Jatropha curcas L.）籽粕（Seed cake）中筛选获得阳离子麻疯树AMP（KVFLGLK与JCpep7），通过抑菌活性测试发现，JCpep7对伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均有较强的抗菌活性。值得注意的是，相比于革兰氏阴性菌，JCpep7对革兰氏阳性菌更为敏感。Tang等[36]利用大肠杆菌细胞膜制得的细菌细胞膜脂质体色谱柱（Bacterial membrane liposome chromatography，IBMLC），从鳀鱼提取物中，纯化获得了一种新型阳离子AMP：Apep10。抑菌活性测定结果表明，Apep10对大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌具有抑制作用，MIC值范围为8~64 μg/mL；溶血实验也表明，低于20 μg/mL的Apep10对小鼠红细胞几乎没有细胞毒性，是一种潜在的食品防腐剂和抗菌药物。显然，细胞膜色谱法比传统的活性制导分离法具有更高效、更快速、更灵敏及可重复性高的优势，但是该方法需将收集的菌膜包覆在大孔硅胶上，制备过程较为繁琐，且在筛选过程中细胞膜容易流失及失去活性，使用寿命较短、成本也相对较高；同时，对细胞膜的高需求以及较低的AMP捕获量，限制了其大规模应用。

深入研究表明细菌细胞膜由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成，磷脂双分子层是细胞膜的基本骨架，主要成分包括磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholin，PC）、磷脂酰甘油（Phosphatidylglycerol，PG）、心磷脂（Cardiolipin，CL）等，而AMP正是通过对特定磷脂成分（如PG和/或CL等）的特异性识别而发挥作用。磷脂膜色谱法（Phospholipid membrane chromatography）正是模拟磷脂膜来构建人工模拟细胞膜，用不同方法，从不同角度探究AMP与磷脂膜之间的作用。Tang等[37]使用蛋黄磷脂酰胆碱（Egg-yolk phosphatidylcholine，EYPC）和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（Dimyristoyl-sn-glycero-phosphatidylglycerol，DMPG）为单体，构建人工模拟细胞膜固定相，以此模拟AMP与细胞膜的相互作用，结合固相萃取与高效液相技术，成功从卵白蛋白水解物中筛选到新型AMP Opep12（肽序为：RVASMASEKMKI），该AMP对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑菌活性。该方法是细胞膜色谱法的延伸，使用仿生磷脂模拟生物细胞膜，可避免生物菌膜活性降低及细胞膜大规模获取困难的问题，具有使用寿命长、可选择性多、操作简单、制备简易等优点，在保证特异性的基础上大幅提高其稳定性。但是，磷脂膜色谱法与真实的活性细胞膜还存在着一定的区别；此外，受限于商品化磷脂的种类，这些模拟细胞膜材料在仿生性和特异性上还有所欠缺。

毛细管电泳法（Capillary electrophoresis，CE）是基于AMP有效电荷和相对分子质量比例与离子迁移率的高度相关性，实现对已知氨基酸序列AMP的筛选。其核心仍然是基于AMP与膜结合的原理，建立与活菌结合的毛细管电泳模型，利用模型中的两者亲和力作用实现筛选。Tůmová等选取12条已知序列的阳离子AMP化合物（在可变区域设定3~7个碱性氨基酸），构建毛细管电泳模型，分别考察AMP有效电荷以及离子迁移率等物理-化学参数。结果表明，采用毛细管电泳法测定聚阳离子AMP的有效电荷和离子迁移率呈相关性，发现了具有10~12个氨基酸残基的较短HAL型AMP的有效电荷与相对分子质量之比高于具有4~6个较长氨基酸残基的HYL型AMP。Šolínová等采用此方法通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，从大白蛉幼虫血淋巴提取物中分离出二肽β-丙氨酰酪氨酸（β-Ala-Tyr），对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有抗菌活性，也有抗真菌性。CE法筛选效率高、重现性好、筛选速度快，但目前理论依据尚不完善，技术不成熟，因此存在明显局限性，易造成漏检和错检，故国内外的报道较少。

比色法（Colorimetry）是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来检测待测组分的方法。Jelinek等[40]通过利用基于磷脂和聚合物聚二乙炔（Polydiacetylene，PDA）脂质组成的囊泡与AMP相互作用时表现出显着的颜色变化，从而实现AMP（K7L-蜂毒肽和W19-蜂毒肽）的筛选。Pan等用此方法对亚洲海洋蛤蜊Perinereis aibuhitensis Grube的匀浆经浓缩、纯化、汇集吸收峰并在冻干后测定微生物的活性，发现了一种新肽命名为：Perinerin，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌和真菌均显示出显著的活性，这也表明具有杀菌作用。Perinerin 有可能作为一种方便的“评估标记”来研究宿主生物化学的变化，特别是在环境变化方面。此类方法甚至能在几秒内得到天然肽类似物，并提供有关肽-膜相互作用和膜通透性机制的结构和功能信息，具有操作简单、快速有效等优势；但同时适用范围有限，选择性待提高。

薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）是采用薄层色谱分离和生物活性测定相结合的生物技术，是一种直观、可视化的筛选方法。Jaskiewicz等提出了一种快速分离、筛选AMP的薄层色谱法，粗肽在薄层板上分离后，将预先制备的板加入微生物悬浮液并进行孵化，用细胞染色剂刃天青（Resazurin）预处理薄层板，潜在AMP成分将会在该区域出现染色的黄色斑点；使用标准AMP进行试验，证实了方法的可行性。其中CAMEL（KWKLFKKIGAVLKVL-NH2）和脂肽PAL-KK-NH2、Pal-KGK-NH2在最低浓度下的抗菌活性最有效。Ramya等用此方法对海蛞蝓中的抗菌化合物进行筛选，使用丙酮、丁酮、乙醇等不同溶剂的提取，在硅胶板均匀厚涂提取物并喷洒定位试剂（茚三酮试剂）时，观察到TLC板上出现紫色至粉红色斑点；该板显示粉红色斑点，表明存在氨基酸和肽。该方法为快速有效地筛选活性肽提供了可能性，可直观从薄层板中寻找到潜在的AMP成分，然而该方法的分离能力有限，仅适用于简单样品的分析，难以满足复杂体系的分离与筛选

荧光筛选法（Fluorescence screening）是一种通过使用荧光染料检查细胞对荧光染料的摄取情况或者测量细胞内成分泄漏来筛选AMP的方法[50]。Kodedová等[43]通过使用新开发的荧光diS-C3（3）检测方法与 96 微孔板结合，从群居性蜜蜂（Lasioglossum laticeps）的毒液中分离出Lasioglossin LL-III，测试并比较了蜜蜂毒液中分离的肽及其合成类似物，对念珠菌的7种菌株，具有生物技术潜力的非传统酵母和14株酿酒酵母均有效。Pasupuleti等[44]利用β-半乳糖苷酶能降解非显色底物邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷（β-D-galactopyranoside，ONPG）为显色底物邻硝基苯酚（O-Nitrophenolate，ONP）的特性，通过AMP将β-半乳糖苷酶从大肠杆菌细胞质中流出来并切割ONPG以产生ONP，该方法可在4 h内得出化合物的抗菌活性，测定肽GKH175W和KNK5W在低pH和高盐浓度的有效性。该方法筛选灵敏度高、消耗量少、快速、成本低，精确度高且不需要载体，但可测量的化合物数量少，有些化合物反应荧光持续的时间较短，荧光的发散方向不集中。

基于基因的高通量测序的筛选方法（High-throughput sequencing，HTS）是近几年正在发展的新兴的AMP筛选技术之一，根据AMP的基因具有同源序列相似性的特点实施精准筛选。Yi等用此方法根据弹涂鱼（Boleophthalmus pectinirostris，BP）和大鳍弹涂鱼（Periophthalmus magnuspinnatus，PM）的基因组和转录，鉴定出507个AMP转录本。在被鉴定的AMP中，449个序列是此前未曾出现的，且大部分的AMP在两种弹涂鱼中的转录模式是不同的，并发现两种AMP（血红蛋白β1和淀粉样蛋白），对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）具有高度抑制作用。该方法高效快速，可一次性获得大量AMP的信息，但具有一定局限性，必须依赖已知的AMP的基因为模板预测基因序列，并且只对同源性物种有效。目前常规分析软件已经不能满足大量的数据资料的需求，只有进一步发展出快速准确的分析软件和方法才能更好地展现高通量测序技术的优势和应用价值。

数据库挖掘法（Mining databases screening）是在生物活性筛选之前，利用数据库中的分子对接软件模拟目标靶点与候选药物之间的相互作用，计算两者之间的亲和力大小，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物发现效率。AMP数据库挖掘法包含来自不同生物来源的候选肽，如细菌、昆虫、蛛形纲动物、被膜动物、两栖动物、鱼类和哺乳动物等。Menousek等[46]基于“APD专业数据库”评估了30种潜在的肽对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）的抑制效果，发现了6种有效的抗 MRSA 候选药物，并获得了一种易于生产的合成类AMP（DASamP1），其能有效防止金黄色葡萄球菌生物膜建立。Liu等对自建的“内源性牛乳肽数据库”进行虚拟筛选，筛选出248种多肽中有23个被确定为具有抗菌作用的候选肽，利用此方法表明乳源AMP可能作为功能性食品成分，有助于揭示乳抗感染作用的分子机制。Yi等[48]利用“Fish-T1K数据库”通过转录组生成的扩展数据集高通量筛选出小免疫肽和AMP，获得了来自87个鳃转录组的小免疫相关肽的大规模数据集，首次阐明不同生境和遗传对小免疫肽和AMP转录数的影响。此外，Universal Protein、ZINC数据库等数据库也是AMP筛选较为常用的数据库。

近年，人工智能法（Artificial intelligence，AI）飞速发展，深度学习（Deep learning）模型为人们从天然产物中快速发现AMP提供了划时代的“武器”；同时，也推动非监督式或半监督式的特征学习和分层特征提取高效算法的发展，可替代固定数据库挖掘模型的手工获取特征。如Chen和他的研究团队采用自然语言学习（Nature language processing，NLP）的多种神经网络方法，把氨基酸序列作为学习语言，训练人工智能学习现有AMP的组织方式，根据经验识别氨基酸短序列，区分相似的多肽。这种模式提高了筛选的“洞察力”及“自动学习性”。通过选取三种NLP神经网络模型来预测鉴定，该研究实现了AMP挖掘模型的构建和优化：在测试集中，该模型的精确度达到了91.31%；对1万多个天然来源微生物组进行筛选后，发现216种潜在的新型AMP，其中83.8%具有抗菌活性。

综上可见该方法效率高、成本较低、精确度高、实时性强，加快AMP的检索速度且保证AMP数据的一致性和安全性，但其结果尚需要进一步验证，一般仅适合初筛。